Diese Methode wird helfen, molekulare Mechanismen eines facettenreichen biologischen Phänomens zu veranschaulichen. Wie die Mechanobiologie, die optische Elektrophysiologie und die hochauflösende DNA/RNA-Protein-Bildgebung mit automatischen Live-Cell-Imaging-Techniken. Dieses Protokoll ermöglicht automatische, multifunktionale, hochdurchsatzreiche, selbstdriftkorrigierende und langfristige Bilderfassung.
Es ist kompatibel mit den meisten fluoreszierenden mikroskopischen Plattformen wie NYCOM. Jeder, der diese Technik zum ersten Mal ausprobiert, sollte die Funktion jedes Schritts verstehen, anstatt nur dem Protokoll streng zu folgen, um ein erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Beginnen Sie, indem Sie die Umgebungskammer auf die motorisierte Stufe des inversen Mikroskops stellen.
Stellen Sie den CO2-Durchfluss auf 160 Milliliter pro Minute ein und stellen Sie die Temperatur der Kammer ein. Dann fügen Sie 40 Milliliter gereinigtes Wasser in das Bad der Kammer hinzu. Nehmen Sie die Glasboden-Petrischale mit Zellen aus dem Inkubator heraus und stellen Sie sie in die Umgebungskammer.
Schalten Sie den konfokalen Controller und das inverse Mikroskop ein. Schalten Sie den Lichtweg nach rechts. Beobachten Sie die Zellen, die sich mit Micro Manager verbinden.
Wenn genügend Zellen an das Gel gebunden wurden, übertragen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator. Wenn nicht, setzen Sie die Zellinkubation für weitere 30 Minuten für B2B und 60 Minuten für Lungenkrebs oder PC-9-Zellen fort. Schneiden Sie 2 kleine Stücke Klebeband und kleben Sie sie auf die Kammer um das kreisförmige Loch.
Tragen Sie dann etwas Klebstoff auf den Bereich des Klebebandes auf, den die Petrischale abdecken wird. Nehmen Sie die Petrischale aus dem Inkubator heraus. Legen Sie die Petrischale langsam in die Kammer und lassen Sie den Boden der Schale mit dem Kleber in Kontakt kommen.
Drücken Sie den Deckel der Petrischale für 1 Minute, damit der Kleber vollen Kontakt mit der Petrischale aufnehmen und erstarren kann. Schieben Sie die Petrischale vorsichtig horizontal, um sicherzustellen, dass der Klebstoff erstarrt ist und sich die Petrischale nicht bewegt. Schließen Sie dann den Deckel der Kammer.
Öffnen Sie IntelliJ, und legen Sie einen Parameter T1 in Zeile 93 der Datei elements_script.java fest. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert größer ist als die Laufzeit des Makros und der Elemente, die für die konfokale Darstellung eines Sichtfelds verwendet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um das AMFIP IntelliJ-Projekt zu starten.
Klicken Sie auf der Hauptoberfläche von Micro Manager auf die Schaltfläche "Live- und Multi-Dequisition" und schalten Sie dann den Lichtweg des inversen Mikroskops nach rechts, um hellfeldbildende Bilder zu erhalten. Schalten Sie zum 10-fachen Objektiv und öffnen Sie das LED-Licht mit der auf 5% eingestellten Intensität Klicken Sie auf das Lichtweg-Mikroskopobjektiv und die LED-Lampentaste im TI2-Panel der Elemente. Stellen Sie den XY-Joystick und den Knopf der Z-Ebene ein, um die richtige Position und die Fokusebene des Gels auf der Petrischale zu finden.
Verwenden Sie das 10-fache Ziel, um die geeigneten Sichtfelder mehrerer einzelner Zellen zu finden, die an das Gel gebunden sind. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen mehrere Positionen XY im mehrdimensionalen Erfassungsfenster. Klicken Sie auf die Schaltfläche Positionsliste bearbeiten und beobachten Sie das angezeigte Fenster der Bühnenpositionsliste.
Ändern Sie das Ziel auf das 40-fache, erhöhen Sie die Intensität des LED-Lichts auf 15% Stellen Sie die motorisierte XY-Bühne neu ein, um die Sichtfelder zu lokalisieren und die Koordinaten aufzuzeichnen, indem Sie auf die Markierungsschaltfläche im Fenster der Bühnenpositionsliste klicken. Zeichnen Sie 6 bis 7 gewünschte Sichtfelder auf. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern unter im Fenster der Bühnenpositionsliste, um die Koordinaten aufzuzeichnen und T1 als Zeitintervallabschnitt der Bildgebungserfassung in T1 im Zeitpunktabschnitt im mehrdimensionalen Erfassungsfenster einzugeben.
Öffnen Sie Elemente, ändern Sie den Lichtweg nach rechts für konfokale Bildgebung und schalten Sie das LED-Licht aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Interlock entfernen und schalten Sie den FITC-Laserkanal für YAP-Bildgebung ein, indem Sie das FITC-Kontrollkästchen aktivieren. Nachdem Sie die Scangeschwindigkeit auf 1 Bild pro 2 Sekunden eingestellt haben, drehen Sie den Knopf der Z-Ebene, um die Z-Position der angeschlossenen Zellen schnell zu finden.
Notieren Sie die unteren und oberen Grenzwerte für den Z-Stack. Klicken Sie im oberen Menüband auf Makro, wählen Sie Makro-Editor unter dem Makro-Dropdown-Menü und geben Sie die untere und obere Grenze für den Z-Stack in eine Makrodatei ein. Schalten Sie den DAPI-Laserkanal für die Perlenbildgebung ein, indem Sie das DAPI-Kontrollkästchen aktivieren, um die fokussierte Z-Position von Perlen zu finden und aufzuzeichnen.
Gehen Sie zum Makro-Editor und geben Sie die aufgezeichneten Werte in die Makrodatei ein. Um die Aufgabe festzulegen, die motorisierte Bühne mit AMFIP zu bewegen, gehen Sie zu Micro Manager, klicken Sie auf Plug-Ins Automatisierung, um die grafische Benutzeroberfläche von AMFIP zu öffnen. Klicken Sie dann auf die Schaltflächen Punkt hinzufügen oder Punkt entfernen, um die genaue Anzahl der ausgewählten Ansichtsfelder zu ermitteln.
Geben Sie die aufgezeichneten Koordinaten der Sichtfelder in das Koordinatenbedienfeld ein. Definieren Sie die Gesamtversuchszeit im Textfeld Gesamtversuchszeit. Klicken Sie auf die zusätzliche Zeitkonfigurationsschaltfläche und definieren Sie das Zeitintervall T2 für das Verschieben der motorisierten Stufe zu jedem Sichtfeld.
Maximieren Sie die Fenstergröße der Elemente und ziehen Sie die GUI von AMFIP auf die rechte Seite des Bildschirms, um zu vermeiden, dass die GUI die automatischen Operationen des Cursors stört, und klicken Sie dann auf die Eingabetaste. Nachdem das erste Makro abgeschlossen ist. Klicken Sie im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche Erfassen.
Beenden Sie nach Abschluss der Langzeitbildgebung die AMFIP-Aufgabe, indem Sie im Fenster des Automatisierungs-Plug-Ins auf die Schaltfläche Pause und im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche Stopp klicken. Öffnen Sie Elemente und legen Sie die Z-Stack-Bildgebung fest, indem Sie im ND-Erfassungsfenster auf die oberen und unteren Schaltflächen klicken. Schalten Sie den Lichtweg nach rechts und öffnen Sie das LED-Licht.
Entfernen Sie langsam und vorsichtig die Deckel der Kammer und der Petrischale, während Sie die helle Feldansicht auf ein Driften des Sichtfeldes überwachen. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um 0,5 Milliliter SDS-Lösung aufzunehmen. Halten Sie die Kunststoffpipette vorsichtig etwas oberhalb des Kulturmediums in der Petrischale und geben Sie 1 bis 2 Tröpfchen der SDS-Lösung in das Kulturmedium.
Sobald die Zellen und die helle Feldansicht aufgelöst sind, schließen Sie das LED-Licht, schalten Sie den Lichtpfad nach links, klicken Sie auf die Schaltfläche Interlock entfernen. Führen Sie das Z-Stack-Imaging aus und speichern Sie den Image-Stack als reference_N, wobei N die Sequenznummer jedes Sichtfelds ist. Klicken Sie im mehrdimensionalen Erfassungsfenster auf die Schaltfläche XY mit mehreren Positionen.
Wählen Sie dann das nächste Sichtfeld aus und klicken Sie auf die Go-to-Schaltfläche, um die motorisierte Stufe zum zweiten Sichtfeld zu bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Sichtfeld. Die Kernlokalisation ist von Ja-assoziiertem Protein oder YAP in B2B-Ellen mit zunehmender Substratsteifigkeit erhöht, während PC-9-Zellen eine ähnliche YAP-Konzentration im Zellkern und Zytoplasma auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit zeigten.
Die B2B-Zelle vergrößerte monoton die Ausbreitungsfläche im Laufe der Zeit, zusammen mit einer Abnahme des YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses, während die PC-9-Zelle während des gesamten 10-stündigen Ausbreitungsprozesses eine vergleichsweise unveränderliche Zellausbreitungsfläche, Orientierung und YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis beibehielt. Während der 10-stündigen Dauer der frühen Ausbreitung verformte die repräsentative B2B-Zelle konstitutiv die Substratoberfläche und legte Zeit auf, um die Zelltraktion über den gesamten Zellbereich zu entwickeln. Im Gegensatz dazu entwickelte die repräsentative PC-9-Zelle nur an den 2 Enden des Zellkörpers Verschiebung und Traktion, und ihre Traktion nahm nach 7,5 Stunden ab.
Das YAP-Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und die Dipoltraktion von B2B-Zellen schienen zwei unterschiedlichen Trends zu folgen, was darauf hindeutet, dass es zwei Gruppen von B2B-Zellen gegeben haben könnte, die im Experiment koexistierten. In der ersten Gruppe nahmen das YAP-Kern-zytoplasmatische Verhältnis und die Dipoltraktion zusammen mit der Vergrößerung der Zellausbreitungsfläche zu und erreichten ihre Maxima bei etwa 1.000 Quadratmikrometern. In der zweiten Gruppe nahmen das YAP-Kern-zytoplasmatische Verhältnis und die Dipoltraktion mit der Vergrößerung des Zellausbreitungsbereichs langsamer zu und hielten nahezu konstante Werte aufrecht, wenn die Zellausbreitungsfläche weiter zunahm.
Die Z-Stack-Bereiche für alle Laserkanäle müssen sorgfältig bestimmt werden, um die potenzielle Drift des Sichtfeldes während der Bühnenbewegung in der Langzeitbildgebung zu überwinden. Diese neuartige Technik ermöglicht eine automatische, nicht-invasive Langzeit- und Multipositionsbildgebung und kann dazu beitragen, den molekularbiologischen Mechanismus aufzuklären, der eine zeitliche und räumliche Verfolgung von Zellen und Organellen erfordert.
