Bu yöntem, çok yönlü bir biyolojik fenomenin moleküler mekanizmalarını göstermeye yardımcı olacaktır. Mekanobiyoloji, optik elektrofizyoloji ve otomatik canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak süper çözünürlüklü DNA/RNA protein görüntüleme gibi. Bu protokol otomatik, çok işlevli, yüksek aktarım hızı, kendi kendine sürüklenen düzeltme ve uzun vadeli görüntü alımını sağlar.
NYCOM gibi floresan mikroskobik platformların çoğuyla uyumludur. Bu tekniği ilk kez deneyen herkes, başarılı bir deneme sağlamak için yalnızca protokolü kesinlikle takip etmek yerine her adımın işlevini anlamalıdır. Çevre odasını ters mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirerek başlayın.
CO2 akış hızını dakikada 160 mililitreye ayarlayın ve haznenin sıcaklığını ayarlayın. Daha sonra odanın banyosuna 40 mililitre arıtılmış su ekleyin. Cam tabanlı Petri kabını inkübatörden hücrelerle dışarı çıkar ve çevre odasına yerleştirin.
Konfokal denetleyiciyi ve ters mikroskobu açın. Işık yolunu sağa doğru değiştirin. Mikro Yönetici'yi kullanarak takılan hücreleri gözlemleyin.
Jel için yeterli hücre tutturulmuşsa, Petri kabını inkübatöre geri aktarın. Değilse, hücre inkübasyonuna B2B için 30 dakika, akciğer kanseri veya PC-9 hücreleri için 60 dakika daha devam edin. 2 küçük yapışkan bant parçası kesin ve dairesel deliğin etrafındaki hazneye yapıştırın.
Daha sonra Petri kabının kaplayacağı bant alanına biraz yapışkan yapıştırıcı uygulayın. Petri kabını inkübatörden çıkar. Petri kabını yavaşça hazneye yerleştirin ve kabın tabanının tutkalla temas edelim.
Yapıştırıcının Petri kabıyla tam temas etmesini ve katılaşması için Petri kabının kapağına 1 dakika bastırın. Tutkalın katılaştığından ve Petri kabının hareket etmediğine emin olmak için Petri kabını yatay olarak hafifçe itin. Sonra odanın kapağını kapatın.
IntelliJ'i açın ve dosya elements_script.java 93. Bu değerin makronun çalışma süresinden ve bir görüş alanının konfokal görüntülemesi için kullanılan öğelerden daha büyük olduğundan emin olun. AMFIP IntelliJ projesini başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
Micro Manager'ın ana arabiriminde canlı ve çoklu deakquisition düğmesine tıklayın, ardından parlak alan görüntüleme için ters mikroskobun ışık yolunu sağa çevirin. 10 kez hedefe geçin ve LED ışığını % 5'te ayarlanan yoğunlukla açın TI2 panel elemanlarındaki ışık yolu mikroskop hedefine ve LED lamba düğmesine tıklayın. Petri kabındaki jelin doğru konumunu ve odak düzlemini bulmak için XY joystick'i ve Z düzleminin düğmesini ayarlayın.
Jel bağlı birden fazla tek hücrenin uygun görüş alanlarını bulmak için 10 kez amacını kullanın. Çok boyutlu edinme penceresinde birden çok konum XY kutusunu işaretleyin. Konum listesini düzenle düğmesine tıklayın ve açılan sahne alanı konum listesi penceresini gözlemleyin.
Hedefi 40 kez değiştirin, LED ışığının yoğunluğunu % 15'e çıkarın Görünüm alanlarını bulmak ve sahne konumu listesi penceresindeki işaretle düğmesine tıklayarak koordinatları kaydetmek için XY motorlu sahneyi yeniden düzenleyin. İstenen 6 ila 7 görüş alanını kaydedin. Çok boyutlu alım penceresindeki zaman noktası bölümünde T1'e görüntüleme alımının zaman aralığı bölümü olarak koordinatları ve giriş T1'i kaydetmek için sahne alanı konum listesi penceresindeki Farklı Kaydet düğmesini tıklatın.
Öğeleri açın, konfokal görüntüleme için ışık yolunu sağa değiştirin ve LED ışığını kapatın. Ardından kilitlemeyi kaldır düğmesine tıklayın ve FITC kutusunu işaretleyerek YAP görüntüleme için FITC lazer kanalını açın. Tarama hızını 2 saniyede 1 kareye ayarladıktan sonra, bağlı hücrelerin Z konumunu hızlı bir şekilde bulmak için Z düzleminin düğmesini döndürün.
Z yığını için alt ve üst sınırları kaydedin. Üst şeritteki makroyu tıklatın, makro açılır menüsünün altında makro düzenleyicisini seçin ve Z yığınının alt ve üst sınırlarını bir makro dosyasına girin. Boncukların odaklanmış Z konumunu bulmak ve kaydetmek için DAPI kutusunu işaretleyerek boncuk görüntüleme için DAPI lazer kanalını açın.
Makro düzenleyicisine gidin ve kaydedilen değerleri makro dosyasına girin. AMFIP kullanarak motorlu sahneyi taşıma görevini ayarlamak için Mikro Yönetici'ye gidin, AMFIP'nin grafik kullanıcı arayüzünü açmak için eklenti otomasyonu tıklayın. Ardından, seçilen görünüm alanlarının tam sayısını elde etmek için nokta ekle'ye tıklayın veya nokta düğmelerini kaldırın.
Görünüm alanlarının kaydedilen koordinatlarını koordinatlar paneline girin. Toplam deneme süresi metin alanında toplam deneme süresini tanımlayın. Ek zaman yapılandırma düğmesine tıklayın ve motorlu sahneyi her FOV'a taşımanın zaman aralığı T2'yi tanımlayın.
Öğelerin pencere boyutunu en üst düzeye çıkarın ve GUI'nin imlecin otomatik işlemlerini rahatsız etmesini önlemek için AMFIP'nin GUI'sini ekranın sağ tarafına sürükleyin ve ardından enter düğmesine tıklayın. İlk makro bittikten sonra. çok boyutlu edinme penceresindeki edinme düğmesine tıklayın.
Uzun süreli görüntülemeyi bitirdikten sonra, otomasyon eklenti penceresindeki duraklat düğmesine ve çok boyutlu alım penceresindeki durdur düğmesine tıklayarak AMFIP görevini durdurun. ND alma penceresindeki üst ve alt düğmeleri tıklatarak öğeleri açın ve Z yığını görüntülemeyi ayarlayın. Işık yolunu sağa doğru değiştirin ve LED ışığını açın.
Görüş alanının herhangi bir sürüklenmesi için parlak alan görünümünü izlerken odanın ve Petri kabının kapaklarını yavaşça ve dikkatlice çıkarın. 0,5 mililitre SDS çözeltisi almak için plastik bir pipet kullanın. Plastik pipetleri Petri kabındaki kültür ortamının biraz üzerinde dikkatlice tutun ve kültür ortamına SDS çözeltisinin 1 ila 2 damlacığı ekleyin.
Hücreler ve parlak alan görünümü çözüldükten sonra LED ışığını kapatın, ışık yolunu sola geçirin, kilitlemeyi kaldır düğmesine tıklayın. Z yığını görüntülemesini çalıştırın ve görüntü yığınını reference_N olarak kaydedin; Çok boyutlu alım penceresindeki birden fazla konum XY düğmesine tıklayın.
Ardından bir sonraki görüş alanını seçin ve motorlu sahneyi ikinci FOV'a taşımak için git düğmesine tıklayın. Her görünüm alanı için bu adımı yineleyin. Nükleer lokalizasyon, B2B ell'lerde yea ilişkili protein veya YAP'ın artan substrat sertliği ile artarken, PC-9 hücreleri çekirdekte benzer YAP konsantrasyonu ve değişen sertlikteki substratlarda sitoplazma göstermiştir.
B2B hücre monoton olarak zaman içinde yayılma alanını artırdı, YAP nükleer ila sitoplazmik oranında bir azalma ile birlikte, PC-9 hücresi 10 saatlik yayılma süreci boyunca nispeten değişmeyen bir hücre yayılma alanı, oryantasyon ve YAP nükleer sitoplazmik oranını korudu. Erken yayılmanın 10 saatlik süresi boyunca, temsili B2B hücresi, substrat yüzeyini tam olarak deforme etti ve tüm hücre alanı boyunca hücre çekişini geliştiren zaman uyguladı. Buna karşılık, temsili PC-9 hücresi sadece hücre gövdesinin 2 ucunda yer değiştirme ve çekiş geliştirdi ve çekişi 7,5 saat sonra azaldı.
B2B hücrelerinin YAP nükleer to sitoplazmik oranı ve dipol çekişi iki farklı eğilimi takip ediyor gibi görünüyordu, bu da deneyde bir arada bulunan iki grup B2B hücresi olabileceğini düşündürmektedir. İlk grupta, YAP nükleer ila sitoplazmik oran ve dipol çekişi, hücre yayılma alanının genişlemesi ile birlikte artmış ve yaklaşık 1.000 kare mikrometrede maksimalarına ulaşmıştır. İkinci grupta ise yap nükleer to sitoplazmik oran ve dipol çekişi hücre yayılma alanının genişlemesi ile daha yavaş bir hızda artmış ve hücre yayılma alanı artmaya devam ettiğinde neredeyse sabit değerler korunmuştır.
Uzun süreli görüntülemede sahne hareketi sırasında görüş alanının potansiyel sürüklenmesinin üstesinden gelmek için tüm lazer kanalları için Z yığın aralıklarının dikkatlice belirlenmesi gerekir. Bu yeni teknik, otomatik, non-invaziv uzun süreli ve çoklupozisyon görüntülemeyi mümkün kılabilir ve hücrelerin ve organellerin zamansal ve mekansal takibini gerektiren moleküler biyoloji mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilir.
