Este protocolo describe un ensayo celular para monitorear la eficiencia de empalme, utilizando un informador de administración adaptable. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar los efectos de las mutaciones asociadas a la enfermedad en los sitios Exxon o de empalme, y para diseñar terapia, particularmente una partícula, para mejorar el reconocimiento de los sitios de empalme mutantes a cinco puntos. El paso en las células Hela aspira el medio gastado e incuba las células con tres mililitros de 0,2 5%viajes en la que contienen un milimolar EDTA, a 37 grados centígrados durante tres minutos.
Después de la incubación a siete mililitros de DMEM fresco y transferir la suspensión celular a un tubo de 10 mililitros. Centrifugar las células. Luego resuspenda el pellet celular en 10 mililitros de DMEM fresco y coloque las células en una nueva placa de cultivo de tejidos al 20% de confluencia, para transfección transitoria.
Cuente las células hela con un portaobjetos de hemo citómetro limpio y prepare una suspensión con una densidad de 2.5 veces 10 a la quinta célula por mililitro, selle un mililitro de la suspensión celular en cada pozo de una placa de 12 pocillos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente aspirar el medio gastado y añadir 800 microlitros de DMEM fresco con suero a la placa. Preparar las mezclas de transfección y Vortex durante 15 segundos.
Luego centrifuga las mezclas e incuérralas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue los 200 microlitros de la mezcla de transfección en un pozo de la placa de células hela de 12 pocillos para lograr un volumen final de un mililitro por pozo, e incube la placa a 37 grados Celsius durante 48 horas. Las reacciones de etiquetado preparadas se están incubando.
Resusped las perlas de exclusión de tamaño de corte de peso molecular Dalton de 25 kilos mediante un vórtice suave durante 10 segundos. A continuación, transfiera 600 microlitros de las cuentas resuspendidas a una mini columna desechable, colocada en un tubo de recolección de 1,5 mililitros, y devuelva el stock de cuentas a cuatro grados centígrados. Centrifugar la columna y descartar el flujo a través de ellas.
Luego lave las perlas dos veces agregando 300 microlitros de agua libre de ARN a la columna. Después del segundo lavado, transfiera la mini columna a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y agregue la mezcla de reacción de quinasa a la columna. Centrifugar la columna y recoger el flujo a través de la contención de los oligonucleótidos marcados P32.
Agregue dos microgramos de ARN extraído de las células heli en tubos de microcentrífuga de 200 microlitros y agregue agua libre de ARN para completar el volumen a 6.55 microlitros. A continuación, agregue 0.9 microlitros, una mezcla maestra a cada tubo de PCR que contenga las muestras de ARN, e incube los tubos primero a 65 grados Celsius durante cinco minutos, y luego en hielo durante un minuto. A continuación, a 2,55 microlitros, una mezcla maestra de dos, a cada tubo que contiene el ARN y una mezcla maestra uno, e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la incubación, transfiera los tubos a un termociclador e incube primero a 50 grados centígrados durante 60 minutos, y luego a 70 grados centígrados, durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue 10 microlitros de colorante de carga de ARN de formamida 2X a cada muestra, y proceda a separar los fragmentos por página UIA. Síntesis de ADN de Percy.
Agregue dos microgramos de ARN extraído de las células hela transectadas, en tubos de microncentrífuga de 200 microlitros y agregue agua libre de ARN para compensar el volumen a un bajo 11 microlitros. A continuación, agregue dos microlitros, una mezcla maestra a cada muestra e incube primero a 65 grados Celsius durante cinco minutos, luego en hielo durante un minuto. A continuación, agregue siete microlitros, una mezcla maestra de dos a cada tubo e incube los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de la incubación a 50 grados Celsius durante 60 minutos y 70 grados Celsius durante 15 minutos.
A continuación, para la PCR diluir la reacción del ADN C para producir una concentración de 100 nanogramos por microlitro, y transferir un microlitro de cada muestra de CDNA a nuevos tubos de PCR. Agregue 10.5 microlitros de la mezcla maestra a cada tubo que contenga CDNA y realice la PCR. Uso de un termociclador Después de que se complete la PCR.
Agregue 12.5 microlitros de colorante de carga de ADN de formamida 2X a cada tubo. Calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y proceder a realizar una página UIA. Pipetear cinco microlitros de CDNA diluido en pozos individuales de un triplicado de placa qpcr de 96 pocillos.
A continuación, agregue 10 microlitros de mezcla de PCR en tiempo real a cada pozo, selle las placas con una película óptica y centrífuga para recolectar las reacciones al fondo de los pozos, luego realice el qpcr mientras recopila los valores del ciclo de cuantificación del umbral del amplicón objetivo. Antes de cargar los marcadores y las muestras, enjuague los pozos con tampón TBE para eliminar la urea asentada. Luego cargue 10 microlitros de cada muestra por pozo y ejecute el gel a 300 a 500 voltios durante dos o tres horas, o hasta que el xileno llegue al fondo.
Después de la electroforesis, retire las placas de vidrio del aparato de electroforesis y separe cuidadosamente las dos placas para que el gel quede plano en cualquiera de las superficies de vidrio, luego transfiera el gel a un papel de filtro y cúbralo con una envoltura de plástico, usando un secador de gel, seque al vacío el gel a 80 grados centígrados durante 30 minutos. luego coloque el gel seco en un cassette de imágenes de fósforo para incubar durante la noche a temperatura ambiente. Cuando se expresa en celdas hela, el reportero de corte dup 51 minnijean expresa la transcripción madura de longitud completa en la que Exxon dos se empalma de manera eficiente. Las cinco mutaciones del sitio de empalme primario y dup 51 P reducen la inclusión de Exxon dos del 95 al 30%, lo que lleva a la formación de una transcripción más corta.
La coexpresión de dup 51 P con U15A SNRNA rescata a Exxon dos empalmes y restaura la formación de la transcripción completa. Por el contrario, la coexpresión con la variante salvaje de tipo U1 o U15G no tiene el efecto similar en el empalme dup 51P. La detección de transcripciones de variantes U15A, por extensión primaria utiliza el oligonucleótido U1 siete a 26, que es de 20 nucleótidos largos y pares de bases cerca de la adenina en la quinta posición del SNRNA U1.
En presencia de DATP solo, U1 siete a 26 permite incorporar de dos a tres nucleótidos para el SNRNA U1 tipo salvaje endógeno que produce un producto largo de 22 o 23 nucleótidos. Para las variantes U15A y U15G, la extensión termina después de agregar una sola adenosina que produce un producto de 21 nucleótidos. Después de la normalización a la expresión de SNRNA U2, las variantes transfectadas de U1 wild-type U1 5g y U15A se expresaron de tres a cinco veces sobre el SNRNA endógeno.
La calidad del ARN extraído es crítica para el análisis de empalme. Por lo tanto, el uso de agua libre de ARN y la descontaminación de los servicios con agentes inactivadores de ARN es muy recomendable. El sistema de informes descrito aquí se puede aplicar para estudiar el papel de los ARN de SN U1 en las regulaciones de empalme para revertir el efecto de las mutaciones de empalme de precios flash para el silenciamiento de genes utilizando ARN de modificación de U1SN.
