Los mecanismos de reparación del ADN son muy importantes para mantener la integridad del genoma en todos los organismos vivos. La uracilo-ADN glicosilasa es una proteína crucial de reparación del ADN en la vía básica de reparación de tejidos. Usando la espectrometría de masas MALDI-TOF, podemos detectar directamente el producto AP para el ensayo de actividad enzimática.
El ensayo convencional de glicosilasa requiere trabajo de parto de sustrato. Este método no contiene etiquetas y detecta directamente el cambio de masa de un sustrato de uracilo a un producto AP. Otras ventajas incluyen alta especificidad, versatilidad, escalabilidad, rapidez y facilidad de rendimiento.
Hemos utilizado E.coli uracilo-ADN glicosilasa como ejemplo. Este método se puede modificar fácilmente para otros ensayos de ADN glicosilasa. El personal de laboratorio bien capacitado con habilidades precisas de pipeteo y dilución es esencial.
Se deben utilizar reactivos recién preparados y tampones bajos en sal para obtener mejores señales y menos ruido de fondo. Demostrando el procedimiento estará Hui-Lan Chang, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para un ensayo de ADN glicosilasa utilizando sustrato portador de base de guanina-uracilo de T1 U + 9 dúplex, agregue 70 microlitros de agua, 10 microlitros de glicosilasa de uracilo-ADN 10X o tampón de reacción UDG, cinco microlitros de stock T1 y cinco microlitros de stock U + 9 en un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mililitros.
Cierre el tubo antes de incubarlo en un baño de agua durante 30 minutos a 65 grados centígrados, seguido de 30 minutos a 37 grados centígrados y, finalmente, en hielo durante tres minutos para garantizar el recocido adecuado del dúplex de la plantilla de sustrato. A continuación, en un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue 49 microlitros de tampón de reacción UDG helado frío y un microlitro de UDG diluido, luego prepare diluciones en serie con el tampón UDG para las concentraciones de enzimas deseadas y coloque el UDG diluido en hielo. A continuación, en otro tubo de 1,5 mililitros, agregue nueve microlitros de la mezcla de sustrato preparada y caliéntela previamente a 37 grados centígrados, luego agregue un microlitro del UDG diluido y mueva el tubo para mezclar el contenido.
Centrifugar brevemente la mezcla de reacción y colocar el tubo inmediatamente para la incubación a 37 grados centígrados. Utilice el temporizador para cronometrar la reacción. Para la terminación de la reacción, prepare ácido clorhídrico molar 0.25 y solución base de tris molar 0.23.
Use el medidor de pH para confirmar el pH al preparar el reactivo y probar con una tira de pH antes de operar el paso de terminación de la reacción, luego acidifique 10 microlitros de tris-EDTA con un microlitro de ácido clorhídrico molar 0.25 y asegúrese de que el pH esté alrededor de dos más o menos 0.5. Neutralice la solución con un microlitro de base tris y asegúrese de que el pH final sea de alrededor de 6.5 más o menos 0.5. A continuación, agregue un microlitro de ácido clorhídrico molar 0.25 a la mezcla de reacción para inactivar la enzima y coloque el tubo en hielo durante seis minutos, luego agregue un microlitro de base tris para neutralizar los productos de ADN y evitar la rotura del sitio AP por exposición prolongada al ácido.
Después de agregar 13 microlitros de tris-EDTA para aumentar el volumen de la mezcla de productos para la transferencia de virutas de matriz, coloque el tubo sobre hielo. Finalmente, transfiera los productos de reacción UDG de 25 microlitros de los tubos de microcentrífuga a una placa de microtitulación de 384 pocillos. Abra la puerta del dispensador de nanolitros y cargue la placa de microtitulación de 384 pocillos en el soporte de la placa de la cubierta, luego inserte la matriz de chips en la posición correspondiente de la placa de exploración.
Coloque la placa de exploración cargada en la plataforma de procesamiento del dispensador de nanolitros y cierre la puerta. Toque el botón de ejecución en la pantalla de transferencia y espere a que el instrumento comience a dispensar muestras desde la placa de microtitulación hasta el chip de matriz. A continuación, utilizando la opción de pestaña de visión, muestre la imagen del chip y los volúmenes de dispensación para cada punto durante la dispensación.
Asegúrese de que el volumen manchado en el chip esté en el rango de cinco a 10 nanolitros. Utilizando el programa de aplicación apropiado, prepare un archivo xlsx que contenga el valor de señal predicho M por Z para la importación. A continuación, utilice el programa de aplicación para crear y definir un nuevo ensayo UDG haciendo clic con el botón secundario en la opción importar grupo de ensayo en formato de diseñador y seleccionando el archivo de Excel de la lista desplegable.
A continuación, haga clic con el botón derecho en el botón de la placa del proyecto del cliente y haga clic en la parte superior del árbol de opciones desplegable para establecer una nueva placa de ensayo. A continuación, en el cuadro de diálogo, escriba un nombre de archivo. Y en el menú desplegable Tipo de placa, seleccione el tipo de placa de 384 pocillos.
Presione OK y espere a que aparezca una placa en blanco a la derecha de la pantalla. A continuación, haga clic en la opción de ensayo y seleccione el ensayo en la lista desplegable. Para asignar el ensayo seleccionado a cada posición del punto de muestra en la placa, mueva el cursor a cada posición de la placa en blanco, haga clic para resaltar el pozo y haga clic con el botón derecho para seleccionar agregar placas.
Con un ordenador de sobremesa o portátil, prepare una lista de trabajo en formato xlsx sin encabezado para todas las muestras del chip, haga clic en el botón Agregar nuevo proyecto de muestra y seleccione el archivo de la lista desplegable para importar la lista de trabajo. Busque todos los códigos de muestra de prueba en la lista de trabajo a la izquierda de la pantalla, luego haga clic en un código de muestra en la lista de trabajo y haga clic con el botón derecho en la posición correspondiente de la placa para vincular las pruebas a cada posición. Presione el botón de entrada / salida del espectrómetro de masas para extender la cubierta y sacar el soporte de virutas.
Inserte el chip de muestra en el soporte del chip, coloque el soporte del chip cargado en la cubierta extendida y presione el botón de entrada / salida nuevamente para que el chip de muestra ingrese al instrumento. En el programa de control del espectrómetro de masas, haga doble clic en el icono adquirir. En la ventana de adquisición, haga clic en la pestaña de ejecución automática para iniciar el instrumento y adquirir espectros de masas de las muestras en el chip.
Para el análisis de datos, ejecute el programa de análisis de datos, luego navegue por el árbol de la base de datos y seleccione el ID del chip.Haga clic para resaltar un pozo de destino en el chip y haga clic en el icono de espectro para mostrar el espectro de masas. Haga clic con el botón derecho para elegir el cuadro de diálogo de personalización y recortar un rango de espectro específico en una nueva ventana, luego haga clic en el eje x para escribir los límites superior e inferior de M por Z y presione OK para mostrar el espectro de rango especificado, incluidas las señales de interés. Para medir la altura máxima de las señales M por Z valores correspondientes al sustrato de uracilo, producto AP y plantilla, haga clic en el pico y vea la altura máxima en la esquina superior izquierda de la pantalla.
Finalmente, para guardar el espectro para el mantenimiento de registros, haga clic con el botón derecho en exportar y seleccione el tipo de archivo como JPEG en la lista desplegable. Haga clic en destino y busque el disco para seleccionar el dispositivo de almacenamiento en la lista desplegable, luego escriba el nombre del archivo y haga clic en exportar. El sistema modelo para un ensayo de ADN glicosilasa se muestra aquí.
El ADN de la plantilla de 19 nucleótidos permaneció sin cambios después de la hidrólisis de la glicosilasa. Por lo tanto, la señal podría servir como referencia para la cuantificación del producto AP. La diferencia de un nucleótido entre el sustrato y la plantilla correspondiente produjo un perfil de señal bien separado para ambos.
La señal del producto AP también estaba bien separada de la del sustrato que contenía uracilo. Para el análisis de los datos de EM, se midieron las alturas máximas. El análisis del curso de tiempo para la actividad de UDG en 0.01, 0.02, 0.05 y 0.1 demostró tanto la dosis como la dependencia del tiempo.
Aquí se muestra un ejemplo de diagrama de velocidad de reacción con intensidades relativas de señal MS del producto y sustrato en concentraciones nanomolares. La velocidad de reacción UDG se presenta como nanomoles del sitio AP producidos por segundo. El KM y el VMAX se calcularon a partir de la gráfica de Lineweaver Burk.
La unidad medida de espectrometría de masas MALDI-TOF fue proporcional a la unidad definida de 0,001 unidades a 0,02 unidades con un coeficiente de determinación apreciable. La inhibición de la actividad de la UDG por un inhibidor de la uraciloglicosasinasa se muestra aquí. En presencia de 100 picomoles del inhibidor, la actividad de 0,05 unidades de UDG se inhibió a un nivel indetectable y se encontró que el IC50 era de 7,6 picomoles.
Dado que el tamaño de los AP es lábil y puede hidrolizarse mediante una reacción de eliminación de beta a pH extremo y temperatura elevada, el enfriamiento del ensayo debe realizarse en hielo durante el período definido. Además, use un medidor de pH para asegurarse de que HCL acidifica el tampón de reacción al pH deseado y la base tris neutralizó la mezcla de productos correctamente. Este método también se puede modificar para analizar la ADN glicosilasa bifuncional.
Por ejemplo, U+2 T3 es un sustrato adecuado para el ensayo de formulaciónmidopimidina ADN glicosilasa. Los productos de escisión de la actividad de la ligasa FPG AP pueden ser fácilmente detectados por la masa MALDI-TOF. Este método tiene el potencial de convertirse en el método de referencia para la medición monofuncional de la glicosilasa y también se puede utilizar como una herramienta para la detección de inhibidores de la glicosilasa para el desarrollo farmacéutico.
