I meccanismi di riparazione del DNA sono molto importanti per mantenere l'integrità del genoma in tutti gli organismi viventi. L'uracil-DNA glicosilasi è una proteina cruciale per la riparazione del DNA nel percorso di riparazione dei tessuti di base. Utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF, possiamo rilevare direttamente il prodotto AP per il saggio di attività enzimatica.
Il saggio convenzionale della glicosilasi richiede il lavoro del substrato. Questo metodo è privo di etichette e rileva direttamente il cambiamento di massa da un substrato di uracile a un prodotto AP. Altri vantaggi includono elevata specificità, versatilità, scalabilità, rapidità e facilità di esecuzione.
Abbiamo usato E.coli uracil-DNA glicosilasi come esempio. Questo metodo può essere facilmente modificato per altri saggi di DNA glicosilasi. Personale di laboratorio ben addestrato con accurate capacità di pipettaggio e diluizione sono essenziali.
I reagenti appena preparati e i tamponi a basso contenuto di sale dovrebbero essere utilizzati per segnali migliori e un minore rumore di fondo. A dimostrare la procedura sarà Hui-Lan Chang, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per un test della glicosilasi del DNA utilizzando il substrato di base guanina-uracile del duplex T1 U + 9, aggiungere 70 microlitri di acqua, 10 microlitri di 10X uracil-DNA glicosilasi o tampone di reazione UDG, cinque microlitri di T1 stock e cinque microlitri di U + 9 in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri.
Chiudere il tubo prima di incubarlo a bagnomaria per 30 minuti a 65 gradi Celsius, seguito da 30 minuti a 37 gradi Celsius, e infine sul ghiaccio per tre minuti per garantire la corretta ricottura del modello di substrato duplex. Successivamente, in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, aggiungere 49 microlitri di tampone di reazione UDG ghiacciato e un microlitro di UDG diluito, quindi preparare diluizioni seriali con il tampone UDG per le concentrazioni enzimatiche desiderate e posizionare l'UDG diluito sul ghiaccio. Successivamente, in un altro tubo da 1,5 millilitri, aggiungere nove microlitri della miscela di substrato preparata e preriscaldarlo a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere un microlitro dell'UDG diluito e scorrere il tubo per mescolare il contenuto.
Centrifugare brevemente la miscela di reazione e posizionare immediatamente il tubo per l'incubazione a 37 gradi Celsius. Usa il timer per cronometrare la reazione. Per la terminazione della reazione, preparare 0,25 molare acido cloridrico e 0,23 molare tris base soluzione.
Utilizzare il pHmetro per confermare il pH durante la preparazione del reagente e il test mediante striscia di pH prima di eseguire la fase di terminazione della reazione, quindi acidificare 10 microlitri di tris-EDTA con un microlitro di acido cloridrico molare 0,25 e assicurarsi che il pH sia di circa due più o meno 0,5. Neutralizzare la soluzione con un microlitro di base tris e assicurarsi che il pH finale sia di circa 6,5 più o meno 0,5. Quindi, aggiungere un microlitro di acido cloridrico molare 0,25 alla miscela di reazione per inattivare l'enzima e posizionare il tubo sul ghiaccio per sei minuti, quindi aggiungere un microlitro di base tris per neutralizzare i prodotti del DNA ed evitare la rottura del sito AP mediante esposizione prolungata all'acido.
Dopo aver aggiunto 13 microlitri di tris-EDTA per aumentare il volume della miscela di prodotti per il trasferimento del chip della matrice, posizionare il tubo sul ghiaccio. Infine, trasferire tutti i prodotti di reazione UDG da 25 microlitri dai tubi microcentrifuga a una piastra di microtitolazione a 384 pozzetti. Aprire la porta del distributore di nanolitri e caricare la piastra di microtitolazione a 384 pozzetti sul supporto della piastra del ponte, quindi inserire l'array di chip a matrice nella posizione della piastra scout corrispondente.
Posizionare la piastra di esplorazione caricata sul piano di lavorazione del distributore di nanolitri e chiudere la porta. Toccare il pulsante di esecuzione sulla schermata di trasferimento e attendere che lo strumento inizi a erogare campioni dalla piastra del microtitolazione al chip della matrice. Successivamente, utilizzando l'opzione della scheda di visione, mostra l'immagine del chip e i volumi di erogazione per ciascun punto durante l'erogazione.
Assicurarsi che il volume individuato sul chip sia compreso tra cinque e 10 nanolitri. Utilizzando il programma applicativo appropriato, preparare un file xlsx contenente il valore del segnale previsto M per Z per l'importazione. Quindi utilizzare il programma applicativo per creare e definire un nuovo test UDG facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione Importa gruppo di saggi nel formato di progettazione e selezionando il file Excel dall'elenco a discesa.
Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante della piastra del progetto del cliente e fare clic sulla parte superiore dell'albero delle opzioni a discesa per stabilire una nuova piastra di analisi. Quindi, nella finestra di dialogo, digitare un nome file. E nel menu a discesa del tipo di piastra, selezionare il tipo di piastra a 384 pozzetti.
Premere OK e attendere che venga visualizzata una targhetta vuota sulla destra dello schermo. Quindi, fare clic sull'opzione test e selezionare il test dall'elenco a discesa. Per assegnare il test selezionato a ciascuna posizione del punto campione sulla piastra, spostare il cursore su ciascuna posizione della piastra vuota, fare clic per evidenziare il pozzetto e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare aggiungi placche.
Utilizzando un computer desktop o portatile, preparare una lista di lavoro in formato xlsx senza intestazione per tutti i campioni sul chip, quindi fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo progetto di esempio e selezionare il file dall'elenco a discesa per importare l'elenco di lavoro. Cerca tutti i codici campione di prova nell'elenco di lavoro a sinistra dello schermo, quindi fai clic su un codice campione nell'elenco di lavoro e fai clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrispondente della piastra per collegare i test a ciascuna posizione. Premere il pulsante di ingresso / uscita dello spettrometro di massa per estendere il ponte ed estrarre il supporto del chip.
Inserire il chip campione nel supporto del chip, posizionare il supporto del chip caricato sul ponte esteso e premere nuovamente il pulsante di ingresso/uscita affinché il chip campione entri nello strumento. Nel programma di controllo dello spettrometro di massa, fare doppio clic sull'icona di acquisizione. Nella finestra di acquisizione, fare clic sulla scheda di esecuzione automatica per avviare lo strumento e acquisire spettri di massa dai campioni sul chip.
Per l'analisi dei dati, eseguire il programma di analisi dei dati, quindi sfogliare l'albero del database e selezionare l'ID del chip.Fare clic per evidenziare un bersaglio bene sul chip e fare clic sull'icona dello spettro per mostrare lo spettro di massa. Fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere la finestra di dialogo di personalizzazione e ritagliare un intervallo di spettro specifico in una nuova finestra, quindi fare clic sull'asse x per digitare i limiti superiore e inferiore di M per Z e premere OK per mostrare lo spettro di gamma specificato inclusi i segnali di interesse. Per misurare l'altezza di picco dei valori dei segnali M per Z corrispondenti al substrato uracile, al prodotto AP e al modello, fare clic sul picco e visualizzare l'altezza del picco nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.
Infine, per salvare lo spettro per la registrazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su Esporta e selezionare il tipo di file come JPEG nell'elenco a discesa. Fare clic sulla destinazione e sfogliare il disco per selezionare il dispositivo di archiviazione nell'elenco a discesa, quindi digitare il nome del file e fare clic su Esporta. Il sistema modello per un test della dna glicosilasi è mostrato qui.
Il DNA modello di 19 nucleotidi è rimasto invariato dopo l'idrolisi della glicosilasi. Pertanto, il segnale potrebbe servire come riferimento per la quantificazione del prodotto AP. La differenza di un nucleotide tra il substrato e il modello corrispondente ha prodotto un profilo di segnale ben separato per entrambi.
Il segnale del prodotto AP era anche ben separato da quello del substrato contenente uracile. Per l'analisi dei dati MS, sono state misurate le altezze dei picchi. L'analisi del corso temporale per l'attività UDG a 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 ha dimostrato sia la dipendenza dalla dose che dal tempo.
Un esempio di grafico della velocità di reazione con le relative intensità del segnale MS del prodotto e del substrato in concentrazioni nanomolari è mostrato qui. La velocità di reazione UDG è presentata come nanomoli del sito AP prodotti al secondo. Il KM e il VMAX sono stati calcolati dal diagramma di Lineweaver Burk.
L'unità misurata con spettrometria di massa MALDI-TOF era proporzionale all'unità definita da 0,001 unità a 0,02 unità con un coefficiente di determinazione apprezzabile. L'inibizione dell'attività UDG da parte di un inibitore della glicosilasi uracile è mostrata qui. In presenza di 100 picomoli dell'inibitore, l'attività di 0,05 unità di UDG è stata inibita a un livello non rilevabile e l'IC50 è risultato essere 7,6 picomoli.
Poiché le dimensioni ap sono labili e possono essere idrolizzate da una reazione di eliminazione beta a pH estremo e temperatura elevata, la tempra del saggio deve essere eseguita su ghiaccio per il periodo definito. Inoltre, utilizzare un pHmetro per assicurarsi che HCL acidifichi il tampone di reazione al pH desiderato e tris base neutralizzato correttamente la miscela di prodotto. Questo metodo può anche essere modificato per analizzare la glicosilasi del DNA bifunzionale.
Ad esempio, U + 2 T3 è un substrato adatto per il test della glicosilasi dna formamidopirimidina. I prodotti di scissione dell'attività della legasi FPG AP possono essere facilmente rilevati dalla massa MALDI-TOF. Questo metodo ha il potenziale per diventare il metodo di riferimento per la misurazione della glicosilasi monofunzionale e può anche essere utilizzato come strumento per lo screening degli inibitori della glicosilasi per lo sviluppo farmaceutico.
