DNA 복구 메커니즘은 모든 살아있는 유기체에서 게놈 무결성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 우라실-DNA 글리코실라제는 기본 조직 복구 경로에서 중요한 DNA 복구 단백질입니다. MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 효소 활성 분석을 위해 AP 제품을 직접 검출 할 수 있습니다.
통상적인 글리코실라제 분석은 기질 노동을 필요로 한다. 이 방법은 라벨이 없으며 우라실 기질에서 AP 제품으로의 질량 변화를 직접 감지합니다. 다른 장점으로는 높은 특이성, 다양성, 확장성, 신속성 및 수행하기 쉬운 기능이 있습니다.
우리는 E.coli 우라실-DNA 글리코실라제를 예로 들어 사용했다. 이러한 방법은 다른 DNA 글리코실라제 검정을 위해 용이하게 변형될 수 있다. 정확한 피펫팅 및 희석 기술을 갖춘 잘 훈련 된 실험실 인력은 필수적입니다.
갓 준비된 시약과 저염 버퍼는 더 나은 신호와 적은 배경 소음을 위해 사용되어야합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Hui-Lan Chang이 될 것입니다. T1 U+9 듀플렉스의 구아닌-우라실 염기 함유 기질을 사용하는 DNA 글리코실라제 분석의 경우, 70 마이크로리터의 물, 10 마이크로리터의 10X 우라실-DNA 글리코실라제 또는 UDG 반응 완충액 10 마이크로리터, 5마이크로리터의 T1 스톡, 5마이크로리터의 U+9 스톡을 1.5 밀리리터 멸균 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다.
튜브를 65도에서 30분 동안 수조에서 인큐베이션하기 전에 닫고, 섭씨 37도에서 30분간, 마지막으로 3분 동안 얼음 위에서 3분 동안 배양하여 기판 템플릿 듀플렉스의 적절한 어닐링을 보장한다. 다음으로, 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 49 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 UDG 반응 버퍼와 1 마이크로리터의 희석된 UDG를 첨가한 다음, 원하는 효소 농도에 대해 UDG 버퍼로 연속 희석물을 준비하고 희석된 UDG를 얼음 위에 놓는다. 다음으로, 다른 1.5 밀리리터 튜브에서 준비된 기판 믹스 9 마이크로 리터를 넣고 섭씨 37도에서 예열 한 다음 희석 된 UDG 1 마이크로 리터를 추가하고 튜브를 플릭하여 내용물을 혼합하십시오.
반응 혼합물을 간단히 원심분리하고, 튜브를 즉시 섭씨 37도에서 인큐베이션하기 위해 놓는다. 타이머를 사용하여 반응 시간을 정합니다. 반응 종결을 위해, 0.25 몰 염산 및 0.23 몰 트리스 염기 용액을 준비한다.
반응 종결 단계를 작동시키기 전에 시약을 준비하고 pH 스트립으로 시험 할 때 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인한 다음 10 마이크로 리터의 tris-EDTA를 0.25 몰 염산 1 마이크로 리터로 산성화하고 pH가 0.5 플러스 또는 마이너스 0.5 정도인지 확인하십시오. 한 마이크로 리터의 트리스 염기로 용액을 중화시키고 최종 pH가 약 6.5 더하기 또는 마이너스 0.5인지 확인하십시오. 다음으로, 효소를 불활성화시키고 튜브를 얼음 위에 6 분 동안 놓기 위해 반응 혼합물에 0.25 몰 염산 한 마이크로 리터를 첨가 한 다음 트리스 염기 한 마이크로 리터를 추가하여 DNA 생성물을 중화시키고 산에 장기간 노출되어 AP 부위 파손을 피하십시오.
매트릭스 칩 전달을 위해 생성물 혼합물의 부피를 증가시키기 위해 13 마이크로리터의 tris-EDTA를 첨가한 후, 튜브를 얼음 위에 놓는다. 마지막으로, 모든 25 마이크로리터 UDG 반응 생성물을 마이크로원심분리 튜브로부터 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. 나노리터 디스펜서의 도어를 열고 384웰 마이크로타이터 플레이트를 데크의 플레이트 홀더에 로드한 다음 매트릭스 칩 어레이를 해당 스카우트 플레이트 위치에 삽입합니다.
적재 된 스카우트 플레이트를 나노 리터 디스펜서의 처리 데크에 놓고 문을 닫으십시오. 전송 화면의 실행 버튼을 터치하고 계측기가 마이크로타이터 플레이트에서 매트릭스 칩으로 샘플을 분배하기 시작할 때까지 기다립니다. 그런 다음 비전 탭 옵션을 사용하여 분배 중에 칩의 이미지와 각 지점의 분배 볼륨을 표시합니다.
칩의 발견 된 부피가 다섯 ~ 10 나노 리터의 범위에 있는지 확인하십시오. 적절한 애플리케이션 프로그램을 사용하여 임포트하기 위해 예측된 신호 MxZ 값을 포함하는 xlsx 파일을 준비합니다. 그런 다음 응용 프로그램을 사용하여 디자이너 형식 옵션에서 가져오기 분석 그룹을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 드롭다운 목록에서 Excel 파일을 선택하여 새 UDG 분석을 만들고 정의합니다.
그런 다음 고객 프로젝트 플레이트 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 옵션 트리의 상단을 클릭하여 새 분석 플레이트를 작성하십시오. 그런 다음 대화 상자에서 파일 이름을 입력합니다. 플레이트 유형 드롭다운에서 384-웰 플레이트 유형을 선택합니다.
OK를 누르고 화면 오른쪽에 빈 플레이트가 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 분석 옵션을 클릭하고 드롭다운 목록에서 분석법을 선택합니다. 선택한 분석법을 플레이트의 각 샘플 스폿 위치에 지정하려면 커서를 빈 플레이트의 각 위치로 이동하고 웰을 클릭하여 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 플라크 추가를 선택합니다.
데스크톱 또는 랩톱 컴퓨터를 사용하여 칩의 모든 샘플에 대한 헤더가 없는 xlsx 형식의 작업 목록을 준비한 다음 새 샘플 프로젝트 추가 단추를 클릭하고 드롭다운 목록에서 파일을 선택하여 작업 목록을 가져옵니다. 화면 왼쪽의 작업 목록에서 모든 테스트 샘플 코드를 찾은 다음 작업 목록에서 샘플 코드를 클릭하고 플레이트의 해당 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 테스트를 각 위치에 연결합니다. 질량 분광계의 입력/출력 버튼을 눌러 데크를 확장하고 칩 홀더를 꺼냅니다.
샘플 칩을 칩 홀더에 삽입하고 로드된 칩 홀더를 확장 데크에 놓은 다음 샘플 칩이 계측기에 들어갈 수 있도록 입력/출력 버튼을 다시 누릅니다. 질량 분광계 제어 프로그램에서 획득 아이콘을 두 번 클릭합니다. 획득 창에서 자동 실행 탭을 클릭하여 계측기를 시작하고 칩의 샘플에서 질량 스펙트럼을 획득합니다.
데이터 분석을 위해 데이터 분석 프로그램을 실행한 다음 데이터베이스 트리를 탐색하고 칩 ID를 선택합니다.칩에서 대상 우물을 강조 표시하려면 누르고 스펙트럼 아이콘을 눌러 질량 스펙트럼을 표시합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 사용자 지정 대화 상자를 선택하고 새 창에서 특정 스펙트럼 범위를 자른 다음 x축을 클릭하여 M의 상한과 하한을 Z로 입력하고 OK를 눌러 관심 신호를 포함하여 지정된 범위 스펙트럼을 표시합니다. 우라실 기판, AP 제품 및 템플릿에 대응하는 신호 M의 Z 값에 의해 피크 높이를 측정하려면 피크를 클릭하고 화면의 왼쪽 상단 모서리에 있는 피크 높이를 봅니다.
마지막으로 기록 보관을 위해 스펙트럼을 저장하려면 내보내기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 드롭다운 목록에서 파일 형식을 JPEG로 선택합니다. 대상을 클릭하고 디스크를 찾아 드롭 다운 목록에서 저장 장치를 선택한 다음 파일 이름을 입력하고 내보내기를 클릭하십시오. DNA 글리코실라제 분석을 위한 모델 시스템이 여기에 제시되어 있다.
19개의 뉴클레오티드 주형 DNA는 글리코실라제 가수분해 후에 변하지 않았다. 따라서, 신호는 AP 생성물의 정량화를 위한 기준 역할을 할 수 있다. 기질과 상응하는 주형 사이의 하나의 뉴클레오티드의 차이는 둘 다에 대해 잘 분리된 신호 프로파일을 생성하였다.
AP 생성물의 신호는 또한 우라실 함유 기질의 신호로부터 잘 분리되었다. MS 데이터 분석을 위해, 피크 높이를 측정하였다. 0.01, 0.02, 0.05 및 0.1에서의 UDG 활성에 대한 시간 코스 분석은 투여량 및 시간 의존성 둘 다를 입증하였다.
나노몰 농도에서 생성물 및 기질의 상대적인 MS 신호 강도를 갖는 반응 속도 플롯의 예가 여기에 도시되어 있다. UDG 반응 속도는 초당 생성된 AP 부위의 나노몰로서 제시된다. KM과 VMAX는 Lineweaver Burk 플롯에서 계산되었습니다.
MALDI-TOF 질량 분광법 측정 단위는 0.001 단위에서 0.02 단위까지 정의 된 단위에 비례하여 상당한 결정 계수를 가졌습니다. 우라실 글리코실라제 억제제에 의한 UDG 활성의 억제가 여기에 제시되어 있다. 억제제의 100 피코몰의 존재하에, UDG의 0.05 유닛의 활성은 검출 불가능한 수준으로 억제되었고, IC50은 7.6 피코몰로 밝혀졌다.
AP 크기는 불안정하고 극한의 pH 및 상승된 온도에서 베타 제거 반응에 의해 가수분해될 수 있기 때문에, 분석 담금질은 정의된 기간 동안 얼음 상에서 수행되어야 한다. 또한 pH 측정기를 사용하여 HCL이 반응 완충액을 원하는 pH로 산성화하고 트리스 염기가 생성물 혼합물을 적절하게 중화시키도록 한다. 이 방법은 또한 이관능성 DNA 글리코실라제를 분석하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, U+2 T3은 포르마미도피리미딘 DNA 글리코실라제 분석에 적합한 기질이다. FPG AP 리가아제 활성의 절단 생성물은 MALDI-TOF 질량에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 이 방법은 일관능성 글리코실라제 측정을 위한 참조 방법이 될 가능성이 있으며, 또한 제약 개발을 위한 글리코실라제 억제제 스크리닝을 위한 도구로서 사용될 수 있다.
