מנגנוני תיקון DNA חשובים מאוד לשמירה על שלמות הגנום בכל האורגניזמים החיים. גליקוסיל-DNA Uracil-DNA הוא חלבון תיקון DNA חיוני במסלול תיקון הרקמות הבסיסי. באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF, אנו יכולים לזהות ישירות מוצר AP לבדיקת פעילות אנזימים.
בדיקת גליקוסילאז קונבנציונלית דורשת עבודת מצע. שיטה זו היא ללא תוויות ולזהות ישירות את השינוי ההמוני ממצע uracil למוצר AP. יתרונות נוספים כוללים ספציפיות גבוהה, רב-תכליתיות, מדרגיות, מהירות וקל לביצועים.
השתמשנו E.coli uracil-DNA גליקוסילאז כדוגמה. שיטה זו ניתן לשנות בקלות עבור בדיקות גליקוסילאז DNA אחרים. אנשי מעבדה מאומנים היטב עם צינורות מדויקים וכישורי דילול הם חיוניים.
ריאגנטים טריים ומאגרי מלח נמוכים צריכים לשמש לאותות טובים יותר ורעש רקע פחות. מי שידגים את ההליך יהיה הוי-לאן צ'אנג, דוקטורנט מהמעבדה שלי. לקבלת בדיקת גליקוסילאז DNA באמצעות מצע נושא בסיס guanine-uracil של דופלקס T1 U + 9, להוסיף 70 מיקרוליטרים של מים, 10 מיקרוליטרים של 10X uracil-DNA גליקוסילאז או מאגר תגובת UDG, חמישה מיקרוליטרים של מלאי T1, וחמישה מיקרוליטרים של מלאי U + 9 בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר.
סגור את הצינור לפני הדגירה באמבט מים במשך 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולבסוף על קרח במשך שלוש דקות כדי להבטיח חישול נאות של דופלקס תבנית המצע. לאחר מכן, בצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הוסיפו 49 מיקרוליטרים של מאגר תגובת UDG קר כקרח ומיקרוליטר אחד של UDG מדולל, ולאחר מכן הכינו דילול סדרתי עם מאגר UDG לריכוזי האנזים הרצויים והניחו את ה- UDG המדולל על הקרח. לאחר מכן, בצינור אחר של 1.5 מיליליטר, מוסיפים תשעה מיקרוליטרים מתערובת המצע המוכן ומחממים אותה מראש ב -37 מעלות צלזיוס, ואז מוסיפים מיקרוליטר אחד של UDG המדולל ומזיזים את הצינור כדי לערבב את התוכן.
צנטריפוגה קצרה את תערובת התגובה ומניחים את הצינור מיד לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש בטיימר כדי לתזמן את התגובה. לסיום תגובה, להכין 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית ו 0.23 פתרון בסיס tris טוחנת.
השתמש ב- pH meter כדי לאשר את ה- pH בעת הכנת ריאגנט ובדיקה על ידי רצועת pH לפני הפעלת שלב סיום התגובה, ולאחר מכן חומצה 10 microliters של tris-EDTA עם מיקרוליטר אחד של 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית ולוודא כי ה- pH הוא סביב שני פלוס או מינוס 0.5. נטרלו את הפתרון באמצעות מיקרוליטר אחד של בסיס טריס וודאו שה-pH הסופי הוא בסביבות 6.5 פלוס או מינוס 0.5. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית לתערובת התגובה כדי להשבית את האנזים ולהניח את הצינור על קרח במשך שש דקות, ולאחר מכן להוסיף מיקרוליטר אחד של בסיס tris כדי לנטרל את מוצרי ה- DNA ולהימנע שבירת אתר AP על ידי חשיפה ממושכת לחומצה.
לאחר הוספת 13 מיקרוליטרים של tris-EDTA כדי להגדיל את נפח תערובת המוצר להעברת שבב מטריצה, הנח את הצינור על קרח. לבסוף, העבירו את כל 25 מוצרי התגובה של microliter UDG מצינורות מיקרוצנטריפוגה לצלחת מיקרוטיטר של 384 well. פתח את הדלת של מתקן הננו-ליטר וטען את צלחת המיקרוטיטר 384-well על מחזיק הצלחת של הסיפון, ולאחר מכן הכנס את מערך שבב המטריצה למיקום צלחת הסקאוט המתאימה.
מניחים את צלחת הסקאוט הטעונה על סיפון העיבוד של מתקן הננו-ליטר וסוגרים את הדלת. גע בלחצן הריצה במסך ההעברה והמתן שהמכשיר יתחיל לחלק דגימות מלוחית המיקרוטיטר לשבב המטריצה. לאחר מכן, באמצעות אפשרות כרטיסיית הראייה, הצג את התמונה של השבב ואת אמצעי האחסון לחלק עבור כל נקודה במהלך חלוקה.
ודא שהנפח המנוקד על השבב נמצא בטווח של 5 עד 10 ננו-ליטרים. באמצעות תוכנית היישום המתאימה, הכן קובץ xlsx המכיל את ערך האות החזוי M by Z לייבוא. לאחר מכן השתמש בתוכנית היישום כדי ליצור ולהגדיר בדיקת UDG חדשה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על קבוצת בדיקת הייבוא בתבנית מעצב ובחירה בקובץ Excel מהרשימה הנפתחת.
לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן לוחית הפרוייקט של הלקוח ולחץ על החלק העליון של עץ האפשרויות הנפתח כדי ליצור לוח בדיקה חדש. לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ. וברשימה הנפתחת סוג צלחת, בחר את סוג הצלחת 384-well.
לחץ על אישור והמתן להופעת לוח ריק בצד שמאל של המסך. לאחר מכן, לחץ על אפשרות הבדיקה ובחר את הבדיקה מהרשימה הנפתחת. כדי להקצות את הבדיקה שנבחרה לכל מיקום נקודה לדוגמה בלוח, הזז את הסמן לכל מיקום של הלוח הריק, לחץ כדי לסמן את הבאר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור הוספת לוחות.
באמצעות מחשב שולחני או מחשב נישא, הכן רשימת עבודה בתבנית xlsx ללא כותרת עליונה עבור כל הדוגמאות בשבב ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף פרוייקט לדוגמה חדש ובחר את הקובץ מהרשימה הנפתחת כדי לייבא את רשימת העבודה. חפש את כל קודי מדגם הבדיקה ברשימת העבודה בצד שמאל של המסך, ולאחר מכן לחץ על קוד מדגם ברשימת העבודה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום המתאים של הצלחת כדי לקשר את הבדיקות לכל מיקום. לחץ על כפתור הכניסה / היציאה של ספקטרומטר המסה כדי להרחיב את הסיפון ולהוציא את מחזיק השבב.
הכנס את שבב הדגימה למחזיק השבב, הנח את מחזיק השבב הטעון על הסיפון המורחב ולחץ שוב על כפתור הכניסה/יציאה כדי ששבב הדגימה ייכנס למכשיר. בתוכנית בקרת ספקטרומטר המסה, לחץ פעמיים על סמל הרכישה. בחלון הרכישה, לחץ על כרטיסיית ההפעלה האוטומטית כדי להפעיל את המכשיר ולרכוש ספקטרום מסה מהדגימות על השבב.
לניתוח נתונים, הפעל את תוכנית ניתוח הנתונים ולאחר מכן עיין בעץ מסד הנתונים ובחר את מזהה השבב.לחץ כדי לסמן באר יעד על השבב ולחץ על סמל הספקטרום כדי להציג את ספקטרום המסה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור את תיבת הדו-שיח של ההתאמה האישית ולחתוך טווח ספקטרום מסוים בחלון חדש, ולאחר מכן לחץ על ציר ה- x כדי להקליד את הגבולות העליונים והתחתונים של M by Z ולחץ על אישור כדי להציג את ספקטרום הטווח שצוין כולל אותות העניין. כדי למדוד את גובה השיא של ערכי האותות M by Z התואמים למצע האורסיל, מוצר AP ותבנית, לחץ על הפסגה והצג את גובה השיא בפינה הימנית העליונה של המסך.
לבסוף, כדי לשמור את הספקטרום לשמירת רשומות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ייצוא ובחר סוג קובץ כ- JPEG ברשימה הנפתחת. לחץ על היעד ועיין בדיסק כדי לבחור את התקן האחסון ברשימה הנפתחת ולאחר מכן הקלד את שם הקובץ ולחץ על ייצוא. מערכת המודל לבדיקת גליקוסילאז DNA מוצגת כאן.
ה- DNA של תבנית הנוקלאוטיד 19 נותר ללא שינוי לאחר הידרוליזה של גליקוסילאז. לכן, האות יכול לשמש הפניה לכמות של מוצר AP. ההבדל של נוקלאוטיד אחד בין המצע לבין התבנית המתאימה יצר פרופיל אות מופרד היטב עבור שניהם.
האות של מוצר AP הופרד היטב גם מזה של המצע המכיל אורסיל. עבור ניתוח נתוני טרשת נפוצה, נמדדו שיאי השיא. ניתוח קורס זמן עבור פעילות UDG ב 0.01, 0.02, 0.05, ו 0.1 הדגים הן במינון והן בתלות בזמן.
דוגמה של עלילת קצב תגובה עם עוצמות אות טרשת נפוצה יחסית של המוצר ומצע בריכוזים ננומולריים מוצגת כאן. קצב התגובה UDG מוצג כננומולים של אתר AP המיוצר לשניה. הק.מ.מ. ו-VMAX חושבו מהתכנית של Lineweaver Burk.
יחידת ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF נמדדה הייתה פרופורציונלית ליחידה המוגדרת מ 0.001 יחידות ל 0.02 יחידות עם מקדם ניכר של קביעה. עיכוב של פעילות UDG על ידי מעכב גליקוסילאז uracil מוצג כאן. בנוכחות 100 picomoles של המדכא, הפעילות של 0.05 יחידות של UDG היה מעוכב לרמה בלתי ניתנת לגילוי ואת IC50 נמצא להיות 7.6 picomoles.
מאז גודל AP הם labile וניתן הידרוליזה על ידי תגובת חיסול בטא ב- pH קיצוני וטמפרטורה גבוהה, מרווה לבדיקה צריך להתבצע על קרח לתקופה המוגדרת. כמו כן, השתמש במד pH כדי להבטיח כי HCL חומצי את מאגר התגובה ל- pH הרצוי בסיס tris מנטרל את תערובת המוצר כראוי. שיטה זו יכולה גם להשתנות כדי לנתח גליקוסילאז DNA bifunctional.
לדוגמה, U +2 T3 הוא מצע מתאים לבדיקת גליקוסילאז DNA פורמידופירמידין. מוצרי המחשוף של פעילות FPG AP ligase ניתן לזהות בקלות על ידי מסה MALDI-TOF. שיטה זו יש פוטנציאל להיות שיטת הייחוס עבור מדידת גליקוסילאז מונו-תעשייתי והוא יכול לשמש גם ככלי עבור הקרנת מעכבי גליקוסילאז לפיתוח תרופות.
