Механизмы репарации ДНК очень важны для поддержания целостности генома во всех живых организмах. Урацил-ДНК-гликозилаза является важным белком репарации ДНК в основном пути восстановления тканей. Используя масс-спектрометрию MALDI-TOF, мы можем непосредственно обнаружить продукт AP для анализа активности ферментов.
Обычный анализ гликозилазы требует субстратной обработки. Этот метод не содержит этикеток и непосредственно обнаруживает изменение массы от подложки из урацила к продукту AP. Другие преимущества включают высокую специфичность, универсальность, масштабируемость, быстроту и простоту выполнения.
В качестве примера мы использовали урацил-ДНК-гликозилазу E.coli. Этот метод может быть легко модифицирован для других анализов ДНК-гликозилазы. Важное значение имеет хорошо подготовленный лабораторный персонал, обладающий навыками точного дозирования и разбавления.
Следует использовать свежеприготовленные реагенты и буферы с низким содержанием соли для улучшения сигналов и меньшего фонового шума. Демонстрировать процедуру будет Хуэй-Лань Чанг, аспирант из моей лаборатории. Для анализа ДНК-гликозилазы с использованием субстрата, несущего основание гуанин-урацил, дуплекса T1 U+9, добавьте 70 микролитров воды, 10 микролитров 10X урацил-ДНК-гликозилазы или реакционного буфера UDG, пять микролитров запаса T1 и пять микролитров запаса U+9 в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 миллилитра.
Закройте трубку перед инкубацией на водяной бане в течение 30 минут при 65 градусах Цельсия, затем 30 минут при 37 градусах Цельсия и, наконец, на льду в течение трех минут, чтобы обеспечить надлежащий отжиг субстрата шаблона дуплекса. Далее в новую 1,5-миллилитровую трубку добавляют 49 микролитров ледяного реакционного буфера UDG и один микролитр разбавленного UDG, затем готовят серийные разведения с буфером UDG для требуемых концентраций ферментов и помещают разбавленный UDG на лед. Далее, в еще одну 1,5-миллилитровую трубку, добавляют девять микролитров подготовленной субстратной смеси и предварительно разогревают ее при 37 градусах Цельсия, затем добавляют один микролитр разбавленного UDG и щелкают трубкой, чтобы перемешать содержимое.
Кратковременно центрифугируйте реакционную смесь и поместите трубку сразу для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. Используйте таймер, чтобы рассчитать время реакции. Для прекращения реакции готовят 0,25 молярной соляной кислоты и 0,23 молярного трисового основания раствора.
Используйте рН-метр для подтверждения рН при приготовлении реагента и тестировании рН-полоской перед работой на стадии окончания реакции, затем подкисляют 10 микролитров трис-ЭДТА одним микролитром 0,25 молярной соляной кислоты и обеспечивают, чтобы рН составлял около двух плюс-минус 0,5. Нейтрализуйте раствор одним микролитром основания tris и убедитесь, что конечный рН составляет около 6,5 плюс-минус 0,5. Затем добавьте один микролитр 0,25 молярной соляной кислоты в реакционную смесь для инактивации фермента и поместите трубку на лед на шесть минут, затем добавьте один микролитр основания триса, чтобы нейтрализовать продукты ДНК и избежать разрушения сайта AP путем длительного воздействия кислоты.
После добавления 13 микролитров трис-ЭДТА для увеличения объема продуктовой смеси для матричного переноса стружки поместите трубку на лед. Наконец, перенесите все 25 микролитровых продуктов реакции UDG из микроцентрифужных трубок на 384-луночную микротитровую пластину. Откройте дверцу нанолитрового дозатора и загрузите 384-луночную микротитровую пластину на держатель пластины палубы, затем вставьте матрицу чипов в соответствующее положение скаутской пластины.
Поместите загруженную скаутскую пластину на обрабатывающую палубу нанолитрового дозатора и закройте дверцу. Нажмите кнопку запуска на экране передачи и подождите, пока прибор начнет дозировать образцы с микротитерной пластины на матричную микросхему. Затем, используя опцию vision tab, покажите изображение чипа и объемы дозирования для каждого пятна во время дозирования.
Убедитесь, что пятнистый объем на чипе находится в диапазоне от пяти до 10 нанолитров. Используя соответствующую прикладную программу, подготовьте xlsx-файл, содержащий прогнозируемое значение сигнала M by Z для импорта. Затем с помощью прикладной программы создайте и определите новый анализ UDG, щелкнув правой кнопкой мыши параметр импортной группы анализа в формате конструктора и выбрав файл Excel из раскрывающегося списка.
Затем щелкните правой кнопкой мыши кнопку таблички проекта клиента и щелкните в верхней части раскрывающегося списка, чтобы установить новую пробирную пластину. Затем в диалоговом окне введите имя файла. А в раскрывающемся списке Тип пластины выберите тип плиты на 384 скважины.
Нажмите OK и подождите, пока в правой части экрана появится пустая пластина. Затем щелкните параметр анализа и выберите его из раскрывающегося списка. Чтобы назначить выбранный анализ каждому положению образца на пластине, переместите курсор в каждое положение пустой пластины, щелкните, чтобы выделить колодец, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать добавить таблички.
С помощью настольного или портативного компьютера подготовьте рабочий список в формате xlsx без заголовка для всех образцов на чипе, затем нажмите кнопку добавить новый образец проекта и выберите файл из раскрывающегося списка, чтобы импортировать рабочий список. Найдите все тестовые образцы кодов в рабочем списке в левой части экрана, затем щелкните образец кода в рабочем списке и щелкните правой кнопкой мыши соответствующую позицию пластины, чтобы связать тесты с каждой позицией. Нажмите кнопку входа/выхода масс-спектрометра, чтобы расширить палубу и вынуть держатель чипа.
Вставьте чип образца в держатель чипа, поместите загруженный держатель чипа на расширенную палубу и снова нажмите кнопку входа / выхода, чтобы чип образца вошел в инструмент. В программе управления масс-спектрометром дважды щелкните значок приобретения. В окне получения перейдите на вкладку автозапуска, чтобы запустить прибор и получить масс-спектры из образцов на чипе.
Для анализа данных запустите программу анализа данных, затем просмотрите дерево базы данных и выберите идентификатор чипа.Щелкните, чтобы выделить целевой колодец на чипе, и щелкните значок спектра, чтобы отобразить массовый спектр. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать диалоговое окно настройки и обрезать определенный диапазон спектра в новом окне, затем щелкните по оси X, чтобы ввести верхнюю и нижнюю границы M by Z, и нажмите OK, чтобы показать указанный спектр диапазона, включая интересующие сигналы. Чтобы измерить пиковую высоту сигналов M по значениям Z, соответствующим подложке урацила, изделию AP и шаблону, нажмите на пик и просмотрите пиковую высоту в левом верхнем углу экрана.
Наконец, чтобы сохранить спектр для ведения записей, щелкните правой кнопкой мыши экспорт и выберите тип файла как JPEG в раскрывающемся списке. Нажмите на назначение и просмотрите диск, чтобы выбрать запоминающее устройство в раскрывающемся списке, затем введите имя файла и нажмите кнопку экспорт. Модельная система для анализа ДНК-гликозилазы показана здесь.
19 нуклеотидная шаблонная ДНК осталась неизменной после гидролиза гликозилазы. Таким образом, сигнал может служить ориентиром для количественного определения продукта AP. Разница одного нуклеотида между субстратом и соответствующим шаблоном привела к хорошо разделенному профилю сигнала для обоих.
Сигнал продукта AP также был хорошо отделен от сигнала субстрата, содержащего урацил. Для анализа данных MS были измерены пиковые высоты. Анализ временного курса для активности UDG на 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 продемонстрировал как дозовую, так и временную зависимость.
Приведен пример графика скорости реакции с относительной интенсивностью сигнала МС продукта и подложки в наномолярных концентрациях. Скорость реакции UDG представлена в виде наномолей участка AP, образующихся в секунду. KM и VMAX были рассчитаны по графику Lineweaver Burk.
Измеренная единица масс-спектрометрии MALDI-TOF была пропорциональна определенной единице от 0,001 единицы до 0,02 единицы с заметным коэффициентом определения. Здесь показано ингибирование активности UDG ингибитором урацилгликозилазы. В присутствии 100 пикомол ингибитора активность 0,05 единиц UDG была ингибирована до неопределяемого уровня, и IC50 оказался 7,6 пикомол.
Поскольку размеры АП являются лабильными и могут быть гидролизованы реакцией бета-элиминации при экстремальном рН и повышенной температуре, закалка анализа должна выполняться на льду в течение определенного периода. Кроме того, используйте рН-метр, чтобы гарантировать, что HCL подкисляет реакционный буфер до желаемого pH, а основание триса нейтрализует смесь продукта должным образом. Этот метод также может быть модифицирован для анализа бифункциональной ДНК-гликозилазы.
Например, U+2 T3 является подходящим субстратом для анализа формамидопиримидина ДНК-гликозилазы. Продукты расщепления активности лигазы FPG AP могут быть легко обнаружены по массе MALDI-TOF. Этот метод может стать эталонным методом для измерения монофункциональной гликозилазы, а также может быть использован в качестве инструмента для скрининга ингибиторов гликозилазы для фармацевтической разработки.
