DNA-Reparaturmechanismen sind sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität in allen lebenden Organismen. Uracil-DNA-Glykosylase ist ein entscheidendes DNA-Reparaturprotein im grundlegenden Gewebereparaturweg. Mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie können wir das AP-Produkt für den Enzymaktivitätsassay direkt nachweisen.
Der konventionelle Glykosylase-Assay erfordert Substratarbeit. Diese Methode ist markierungsfrei und erkennt direkt die Massenänderung von einem Uracil-Substrat zu einem AP-Produkt. Weitere Vorteile sind hohe Spezifität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit, Schnelligkeit und einfache Leistung.
Wir haben E.coli Uracil-DNA-Glykosylase als Beispiel verwendet. Diese Methode kann leicht für andere DNA-Glykosylase-Assays modifiziert werden. Gut ausgebildetes Laborpersonal mit genauen Pipettier- und Verdünnungsfähigkeiten ist unerlässlich.
Frisch zubereitete Reagenzien und salzarme Puffer sollten für bessere Signale und weniger Hintergrundgeräusche verwendet werden. Demonstrieren wird das Verfahren von Hui-Lan Chang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Für einen DNA-Glykosylase-Assay unter Verwendung eines Guanin-Uracil-basentragenden Substrats aus T1 U+9-Duplex fügen Sie 70 Mikroliter Wasser, 10 Mikroliter 10-fachen Uracil-DNA-Glykosylase- oder UDG-Reaktionspuffer, fünf Mikroliter T1-Stamm und fünf Mikroliter U+9-Stamm in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
Schließen Sie die Röhre, bevor Sie sie in einem Wasserbad für 30 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schließlich auf Eis für drei Minuten, um ein ordnungsgemäßes Glühen der Substratschablone Duplex zu gewährleisten. Als nächstes fügen Sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 49 Mikroliter eiskalten UDG-Reaktionspuffer und einen Mikroliter verdünntes UDG hinzu, bereiten dann serielle Verdünnungen mit dem UDG-Puffer für die gewünschten Enzymkonzentrationen vor und legen das verdünnte UDG auf Eis. Als nächstes fügen Sie in einem weiteren 1,5-Milliliter-Röhrchen neun Mikroliter der vorbereiteten Substratmischung hinzu und wärmen sie bei 37 Grad Celsius vor, fügen dann einen Mikroliter des verdünnten UDG hinzu und streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen.
Das Reaktionsgemisch kurz zentrifugieren und das Röhrchen sofort zur Inkubation bei 37 Grad Celsius platzieren. Verwenden Sie den Timer, um die Reaktion zu timen. Für den Reaktionsabschluss werden 0,25 molare Salzsäure und 0,23 molare Tris-Basenlösung hergestellt.
Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert bei der Herstellung des Reagenzes und der Prüfung mit dem pH-Streifen zu bestätigen, bevor Sie den Reaktionsabschlussschritt ausführen, dann 10 Mikroliter Tris-EDTA mit einem Mikroliter 0,25 molare Salzsäure ansäuern und sicherstellen, dass der pH-Wert etwa zwei plus oder minus 0,5 beträgt. Neutralisieren Sie die Lösung mit einem Mikroliter Tris-Base und stellen Sie sicher, dass der endgültige pH-Wert etwa 6,5 plus oder minus 0,5 beträgt. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 0,25 molare Salzsäure zu der Reaktionsmischung hinzu, um das Enzym zu inaktivieren, und legen Sie die Röhre für sechs Minuten auf Eis, dann fügen Sie einen Mikroliter Tris-Base hinzu, um die DNA-Produkte zu neutralisieren und einen Bruch der AP-Stelle durch längere Säureeinwirkung zu vermeiden.
Nachdem Sie 13 Mikroliter Tris-EDTA hinzugefügt haben, um das Volumen der Produktmischung für den Matrixchiptransfer zu erhöhen, legen Sie die Tube auf Eis. Übertragen Sie schließlich alle 25-Mikroliter-UDG-Reaktionsprodukte aus Mikrozentrifugenröhrchen auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte. Öffnen Sie die Tür des Nanoliter-Spenders und laden Sie die 384-Well-Mikrotiterplatte auf den Plattenhalter des Decks, dann setzen Sie das Matrix-Chip-Array in die entsprechende Scout-Plattenposition ein.
Legen Sie die geladene Scout-Platte auf das Verarbeitungsdeck des Nanoliter-Spenders und schließen Sie die Tür. Berühren Sie die Ausführungstaste auf dem Übertragungsbildschirm und warten Sie, bis das Gerät mit der Abgabe von Proben von der Mikrotiterplatte an den Matrixchip beginnt. Als nächstes zeigen Sie mit der Option Vision Tab das Bild des Chips und die Dosiervolumina für jede Stelle während der Dosierung an.
Stellen Sie sicher, dass das gefleckte Volumen auf dem Chip im Bereich von fünf bis 10 Nanolitern liegt. Bereiten Sie mit dem entsprechenden Anwendungsprogramm eine xlsx-Datei mit dem vorhergesagten Signalwert M by Z für den Import vor. Verwenden Sie dann das Anwendungsprogramm, um einen neuen UDG-Assay zu erstellen und zu definieren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option Assaygruppe im Designerformat importieren klicken und die Excel-Datei aus der Dropdown-Liste auswählen.
Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Kundenprojektplatte und klicken Sie oben im Dropdown-Optionsbaum, um eine neue Assay-Platte einzurichten. Geben Sie dann im Dialogfeld einen Dateinamen ein. Wählen Sie im Dropdown-Menü Plattentyp den Plattentyp mit 384 Vertiefungen aus.
Drücken Sie OK und warten Sie, bis rechts auf dem Bildschirm eine leere Platte angezeigt wird. Klicken Sie anschließend auf die Assay-Option und wählen Sie den Assay aus der Dropdown-Liste aus. Um den ausgewählten Assay jeder Position des Probenflecks auf der Platte zuzuweisen, bewegen Sie den Cursor an jede Position der leeren Platte, klicken Sie, um den Brunnen zu markieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Plaketten hinzufügen auszuwählen.
Bereiten Sie mit einem Desktop- oder Laptop-Computer eine Arbeitsliste im xlsx-Format ohne Header für alle Proben auf dem Chip vor, klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neues Beispielprojekt hinzufügen und wählen Sie die Datei aus der Dropdown-Liste aus, um die Arbeitsliste zu importieren. Suchen Sie nach allen Testbeispielcodes in der Arbeitsliste auf der linken Seite des Bildschirms, klicken Sie dann auf einen Beispielcode in der Arbeitsliste und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Position der Platte, um die Tests mit jeder Position zu verknüpfen. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste des Massenspektrometers, um das Deck auszufahren und den Chiphalter herauszunehmen.
Stecken Sie den Probenchip in den Chiphalter, legen Sie den geladenen Chiphalter auf das verlängerte Deck und drücken Sie die Ein-/Aus-Taste erneut, damit der Probenchip in das Instrument gelangt. Doppelklicken Sie im Massenspektrometer-Steuerungsprogramm auf das Erfassungssymbol. Klicken Sie im Erfassungsfenster auf die Registerkarte Auto-Run, um das Instrument zu starten und Massenspektren aus den Proben auf dem Chip zu erfassen.
Führen Sie für die Datenanalyse das Datenanalyseprogramm aus, durchsuchen Sie dann den Datenbankbaum und wählen Sie die Chip-ID aus.Klicken Sie, um eine Zielvertiefung auf dem Chip zu markieren, und klicken Sie auf das Spektrumsymbol, um das Massenspektrum anzuzeigen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das Anpassungsdialogfeld auszuwählen und einen bestimmten Spektrumbereich in einem neuen Fenster zuzuschneiden, klicken Sie dann auf die x-Achse, um die oberen und unteren Grenzen von M by Z einzugeben, und drücken Sie OK, um das angegebene Bereichsspektrum einschließlich der interessierenden Signale anzuzeigen. Um die Spitzenhöhe der Signale M by Z-Werte zu messen, die dem Uracil-Substrat, dem AP-Produkt und der Vorlage entsprechen, klicken Sie auf den Peak und sehen Sie sich die Peakhöhe in der oberen linken Ecke des Bildschirms an.
Um das Spektrum für die Aufzeichnung zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren und wählen Sie in der Dropdown-Liste Dateityp als JPEG aus. Klicken Sie auf Ziel und durchsuchen Sie die Festplatte, um das Speichergerät in der Dropdown-Liste auszuwählen, geben Sie dann den Dateinamen ein und klicken Sie auf Exportieren. Hier wird das Modellsystem für einen DNA-Glykosylase-Assay gezeigt.
Die 19 Nukleotid-Template-DNA blieb nach der Glykosylase-Hydrolyse unverändert. Daher könnte das Signal als Referenz für die Quantifizierung des AP-Produkts dienen. Die Differenz eines Nukleotids zwischen dem Substrat und der entsprechenden Schablone ergab für beide ein gut getrenntes Signalprofil.
Auch das Signal des AP-Produkts war gut von dem des Uracil-haltigen Substrats getrennt. Für die MS-Datenanalyse wurden die Spitzenhöhen gemessen. Die Zeitverlaufsanalyse für die UDG-Aktivität bei 0,01, 0,02, 0,05 und 0,1 zeigte sowohl Dosis- als auch Zeitabhängigkeit.
Ein Beispiel für die Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit mit relativen MS-Signalintensitäten des Produkts und des Substrats in nanomolaren Konzentrationen ist hier dargestellt. Die UDG-Reaktionsgeschwindigkeit wird als Nanomol der pro Sekunde produzierten AP-Stelle dargestellt. KM und VMAX wurden aus dem Lineweaver Burk-Diagramm berechnet.
Die gemessene Einheit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie war proportional zur definierten Einheit von 0,001 Einheiten bis 0,02 Einheiten mit einem nennenswerten Bestimmtheitskoeffizienten. Hier wird die Hemmung der UDG-Aktivität durch einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor gezeigt. In Gegenwart von 100 Picomolen des Inhibitors wurde die Aktivität von 0,05 Einheiten UDG auf ein nicht nachweisbares Niveau gehemmt und der IC50 wurde als 7,6 Picomolen befunden.
Da die AP-Größe labil ist und durch eine Beta-Eliminationsreaktion bei extremem pH-Wert und erhöhter Temperatur hydrolysiert werden kann, sollte die Assay-Abschreckung für den definierten Zeitraum auf Eis durchgeführt werden. Verwenden Sie auch ein pH-Messgerät, um sicherzustellen, dass HCL den Reaktionspuffer auf den gewünschten pH-Wert ansäuert und Tris-Base die Produktmischung richtig neutralisiert. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um die bifunktionelle DNA-Glykosylase zu analysieren.
Zum Beispiel ist U+2 T3 ein geeignetes Substrat für den Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase-Assay. Die Spaltprodukte der FPG AP-Ligaseaktivität können leicht durch MALDI-TOF-Masse nachgewiesen werden. Diese Methode hat das Potenzial, die Referenzmethode für die monofunktionelle Glykosylasemessung zu werden und kann auch als Werkzeug für das Glykosylase-Inhibitor-Screening für die pharmazeutische Entwicklung verwendet werden.
