DNA修復機構は、すべての生物においてゲノムの完全性を維持するために非常に重要です。ウラシルDNAグリコシラーゼは、基本的な組織修復経路において重要なDNA修復タンパク質である。MALDI-TOF質量分析法を用いて、酵素活性アッセイのためにAP生成物を直接検出することができる。
従来のグリコシラーゼアッセイは、基質の労力を必要とする。この方法はラベルフリーで、ウラシル基質からAP生成物への質量変化を直接検出します。その他の利点には、高い特異性、汎用性、スケーラビリティ、迅速性、および実行が容易であることが含まれます。
我々は、例として大腸菌ウラシルDNAグリコシラーゼを用いた。この方法は、他のDNAグリコシラーゼアッセイのために容易に改変することができる。正確なピペッティングと希釈のスキルを備えたよく訓練されたラボ担当者が不可欠です。
新しく調製した試薬と低塩緩衝液は、より良い信号とより少ないバックグラウンドノイズのために使用する必要があります。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるHui-Lan Changです。T1 U+9 二重鎖のグアニン - ウラシル塩基含有基質を使用する DNA グリコシラーゼアッセイの場合、1.5 ミリリットルの滅菌微量遠心管に、70 マイクロリットルの水、10 マイクロリットルの 10 倍ウラシル DNA グリコシラーゼまたは UDG 反応バッファー、5 マイクロリットルの T1 ストック、および 5 マイクロリットルの U+9 ストックを加えます。
チューブを閉じてから、水浴中で摂氏65度で30分間、続いて摂氏37度で30分間、最後に氷上で3分間インキュベートして、基板テンプレート二重鎖の適切なアニーリングを確実にします。次に、新しい1.5ミリリットルのチューブに、49マイクロリットルの氷冷UDG反応緩衝液および1マイクロリットルの希釈UDGを加え、次いで、所望の酵素濃度のためにUDG緩衝液で段階希釈物を調製し、希釈UDGを氷上に置く。次に、別の1.5ミリリットルのチューブに、調製した基質混合物の9マイクロリットルを加え、摂氏37度で予温し、次いで希釈されたUDGの1マイクロリットルを加え、チューブをフリックして内容物を混合する。
反応混合物を短時間遠心分離し、直ちにチューブを置き、摂氏37度でインキュベートする。タイマーを使用して反応のタイミングを計ります。反応停止のために、0.25モル塩酸および0.23モルトリス塩基溶液を調製する。
反応終了ステップを操作する前に、試薬を調製し、pHストリップで試験するときにpHメーターを使用してpHを確認し、10マイクロリットルのトリスEDTAを1マイクロリットルの0.25モル塩酸で酸性にし、pHが約2プラスマイナス0.5であることを確認します。1マイクロリットルのトリス塩基で溶液を中和し、最終pHが約6.5プラスマイナス0.5であることを確認します。次に、反応混合物に1マイクロリットルの0.25モル塩酸を加えて酵素を失活させ、チューブを氷上に6分間置いた後、1マイクロリットルのトリス塩基を加えてDNA産物を中和し、酸への長時間の曝露によるAP部位の切断を回避する。
マトリックスチップ移送用の製品混合物の体積を増加させるために13マイクロリットルのtris-EDTAを加えた後、チューブを氷の上に置きます。最後に、25マイクロリットルのUDG反応産物をすべてマイクロ遠心分離管から384ウェルマイクロタイタープレートに移す。ナノリットルディスペンサーのドアを開き、384ウェルマイクロタイタープレートをデッキのプレートホルダーにロードし、マトリックスチップアレイを対応するスカウトプレート位置に挿入します。
装填されたスカウトプレートをナノリットルディスペンサーの処理デッキに置き、ドアを閉じます。転写画面のランボタンをタッチし、機器がマイクロタイタープレートからマトリックスチップへのサンプルの分配を開始するのを待ちます。次に、ビジョンタブオプションを使用して、チップの画像とディスペンス中の各スポットのディスペンス量を表示します。
チップ上の斑点のある体積が5~10ナノリットルの範囲であることを確認します。適切なアプリケーション・プログラムを使用して、インポート用の予測信号 M by Z 値を含む xlsx ファイルを準備します。次に、アプリケーションプログラムを使用して、デザイナー形式でアッセイグループをインポートオプションを右クリックし、ドロップダウンリストからExcelファイルを選択することで、新しいUDGアッセイを作成および定義します。
次に、顧客プロジェクトプレートボタンを右クリックし、ドロップダウンオプションツリーの上部をクリックして、新しいアッセイプレートを確立します。次に、ダイアログボックスでファイル名を入力します。プレートタイプドロップダウンで、384ウェルプレートタイプを選択します。
OKを押して、画面の右側に空白のプレートが表示されるのを待ちます。次に、アッセイオプションをクリックし、ドロップダウンリストからアッセイを選択します。選択したアッセイをプレート上の各サンプルスポット位置に割り当てるには、ブランクプレートの各位置にカーソルを移動し、ウェルをクリックして強調表示し、右クリックしてプラークの追加を選択します。
デスクトップまたはラップトップコンピュータを使用して、チップ上のすべてのサンプルのヘッダーのないxlsx形式の作業リストを準備し、新しいサンプルプロジェクトの追加ボタンをクリックしてドロップダウンリストからファイルを選択して作業リストをインポートします。画面左側の作業リストですべてのテストサンプルコードを探し、作業リストでサンプルコードをクリックし、プレートの対応する位置を右クリックしてテストを各位置にリンクします。質量分析計のイン/アウトボタンを押してデッキを伸ばし、チップホルダーを取り出します。
サンプルチップをチップホルダーに挿入し、ロードされたチップホルダーを拡張デッキに置き、サンプルチップが機器に入るように入出力ボタンをもう一度押します。質量分析計制御プログラムで、取得アイコンをダブルクリックします。集録ウィンドウで、自動実行タブをクリックして装置を起動し、チップ上のサンプルから質量スペクトルを取得します。
データ解析を行うには、データ解析プログラムを実行し、データベースツリーを参照してチップ ID を選択します。クリックしてチップ上のターゲットウェルをハイライト表示し、スペクトルアイコンをクリックしてマススペクトルを表示します。右クリックしてカスタマイズダイアログを選択し、新しいウィンドウで特定のスペクトル範囲をトリミングし、x軸をクリックしてM×Zの上限と下限を入力し、OKを押して目的の信号を含む指定された範囲スペクトルを表示します。ウラシル基板、APプロダクト、およびテンプレートに対応するZ値によって信号Mのピーク高さを測定するには、ピークをクリックして、画面の左上隅にピーク高さを表示します。
最後に、記録保持のためにスペクトルを保存するには、[エクスポート] を右クリックし、ドロップダウン リストで [ファイルの種類] を JPEG として選択します。コピー先をクリックし、ディスクを参照してドロップダウン・リストでストレージ・デバイスを選択し、ファイル名を入力して[エクスポート]をクリックします。DNAグリコシラーゼアッセイのモデル系をここに示す。
19ヌクレオチド鋳型DNAはグリコシラーゼ加水分解後も変化しなかった。したがって、信号はAP生成物の定量のための基準として役立つ可能性がある。基質と対応する鋳型との間の1つのヌクレオチドの相違は、両方のために十分に分離されたシグナルプロファイルを生じた。
AP生成物のシグナルも、ウラシル含有基質のシグナルから十分に分離されていた。MSデータ解析のために、ピーク高さを測定した。0.01、0.02、0.05、および0.1におけるUDG活性の経時変化分析は、線量依存性と時間依存性の両方を示した。
ナノモル濃度における生成物および基質の相対MSシグナル強度を有する反応速度プロットの例がここに示されている。UDG反応速度は、毎秒生成されるAP部位のナノモルとして提示される。KMとVMAXはラインウィーバーバーのプロットから計算された。
MALDI-TOF質量分析測定単位は、0.001単位から0.02単位まで定義された単位に比例し、かなりの決定係数を有していた。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤によるUDG活性の阻害をここに示す。100ピコモールの阻害剤の存在下で、0.05単位のUDGの活性が検出不可能なレベルまで阻害され、IC50は7.6ピコモールであることが見出された。
APサイズは不安定であり、極端なpHおよび高温でのベータ除去反応によって加水分解される可能性があるため、アッセイクエンチは、定義された期間、氷上で実施されるべきである。また、pHメーターを使用して、HCLが反応緩衝液を所望のpHに酸性化し、トリス塩基が生成物混合物を適切に中和したことを確認する。この方法は、二官能性DNAグリコシラーゼを分析するために改変することもできる。
例えば、U+2 T3は、ホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼアッセイに好適な基質である。FPG APリガーゼ活性の切断産物は、MALDI−TOF塊によって容易に検出することができる。この方法は、単官能グリコシラーゼ測定の参考法となる可能性を秘めており、医薬品開発のためのグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングのツールとしても使用可能です。
