ستسمح هذه الطريقة لعزل الخلايا البطانية في شبكية العين بتقنيات تسلسل متقدمة للكشف عن آليات جديدة لتطور الأوعية الدموية. تم تحسين البروتوكول الموصوف للحصول على درجات عالية من الجدوى والنقاء ، والتي تعتبر ضرورية لتطبيقات التسلسل من الجيل التالي. سيوضح الإجراء شيلبي كاين ، طالب دراسات عليا من مختبر هيرشي.
ابدأ في إزالة العينين من الفأر الوليدي المصاب بالقتل الرحيم عن طريق قطع الجلد والغشاء فوق العين بشق عمودي على الجفن باستخدام مقص التشريح. ثم استخدم الملقط للضغط لأسفل أعلى وأسفل العين بحيث تتحرك العين خارج التجويف. قرصة بعناية تحت العين مع ملقط وقطع العصب البصري الذي يبقي العين متصلة.
ثم ضع كلتا العينين من الماوس في بئر من لوحة 48 بئر في PBS المثلج الطازج حتى الانتهاء من الحصاد. لعزل أنسجة شبكية الفأر ، قم بتعليق العينين في وسادة التشريح في طبق بتري مملوء ب 500 ميكرولتر من PBS المثلج باستخدام وسادة أنبوب نقل ذات طرف عريض. العمل تحت مجهر التشريح ، امسك العصب البصري بملقط دقيق واحد واستخدم الملقط الثاني لاختراق الثقب من خلال الغرفة الأمامية للعين حيث تتصل القرنية والصلبة.
ثم تمزيق الثقب في دائرة حوالي 75 ٪ من الطريق حول القرنية. أثناء إمساك العصب البصري بملقط واحد ، استخدم الملقط الثاني لتمزيق الصلبة والجسم الزجاجي برفق من أنسجة الشبكية. لإزالة العدسة وأوعية الضفيرة الهيالويد ، قم بالوصول إلى شبكية العين باستخدام ملقط مفتوح حتى تلمسها تقريبا ثم أغلق الملقط للاستيلاء على العدسة وأوعية الضفيرة الهيالويد وسحبها من شبكية العين.
عند إزالة جميع الأوعية ، ضع شبكية العين في أنبوبي الطرد المركزي الصغيرين المملليلتر المملوءين ب 500 ميكرولتر من جهاز PBS واحد بارد. قم بإزالة PBS الزائد من أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 2 ملليلتر باستخدام ماصة تاركا حوالي 100 ميكرولتر من PBS في الأنبوب لتغطية أنسجة الشبكية بالكامل. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم الطازج إلى الأنبوب.
استخدم ماصة P1000 وطرف ماصة لتحريك أنسجة الشبكية لأعلى ولأسفل في محلول الهضم خمس مرات. عند الانتهاء ، احتضن خليط الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع سحب خليط الهضم لأعلى ولأسفل كل خمس دقائق كما هو موضح من قبل. بعد الحضانة ، سوف تذوب أنسجة الشبكية في تعليق خلية واحدة مما يجعل خليط الهضم غائما.
بعد ذلك ، قم بتكوير الخلايا بالطرد المركزي عند 375 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة PBS من حبيبات الخلية المغسولة عن طريق السحب ثم قم بتلطيخ الخلايا المناعية عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة لكل 0.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة. احتضان معلق الخلية الواحدة بمحلول تلطيخ الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الثلج في الظلام مع النقر على الأنبوب كل 10 دقائق لخلط الخلايا برفق.
لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 375 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل الخلايا وحبيباتها في 500 ميكرولتر من PBS كما هو موضح من قبل. ثم أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو المخزن المؤقت FACS عن طريق الخلط بلطف مع الماصة.
بعد ذلك ، أضف يوديد البروبيديوم أو PI كعلامة جدوى إلى أنابيب العينة التي تحتوي على المخزن المؤقت FACS للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. استخدم ماصة لنقل معلقات الخلايا من خلال غطاء مصفاة الخلية الذي يحتوي على مرشح 35 ميكرون في أنبوب اختبار سعة خمسة ملليلتر. بعد الترشيح ، احتفظ بأنبوب FACS على الجليد في الظلام ثم انقل الأنبوب إلى فارز الخلايا.
قم بتشغيل جهاز FACS والكمبيوتر وافتح برنامج FACS لتشغيل وتشغيل جهاز FACS. إجراء اختبارات مراقبة الجودة الروتينية. قم بتحميل عينات بقعة التحكم في أداة FACS لضبط المحاور.
ابدأ بخلايا الأجسام المضادة IgG فقط لتوليد وضبط التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. ثم CD31 الجسم المضاد فقط لتوليد وضبط CD31. ثم الأجسام المضادة CD45 فقط لتوليد وضبط CD45.
تسجيل البيانات من عينات التحكم. بعد ذلك ، قم بتحميل خلايا العينة الملطخة في أداة FACS وقم بتشغيل العينة. قم بمشية الخلايا بناء على معلمات التشتت الأمامي أو FSC والتشتت الجانبي أو SSC.
خلايا المشي بواسطة FSCA و FSCH لتحديد مضاعفة الخلايا وجمع الخلايا المفردة فقط. خلايا المشي بواسطة PI و SSCA لتحديد الخلايا القابلة للحياة. اصنع مشية CD31 + CD45 باستخدام عناصر التحكم اصنع مشية CD31 + CD45 باستخدام عناصر التحكم وقم بمشية الخلايا بواسطة CD31 و CD45.
أدخل أنبوب تجميع به 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS في الجهاز. بعد ذلك ، ابدأ في فرز الخلايا التي تكون CD31 + CD45 في أنبوب التجميع المثبت. احتفظ بأنابيب التجميع على الجليد لمزيد من التحليل.
يمكن معالجة العينات لتطبيقات التسلسل من الجيل التالي. في الدراسة ، أثر تغيير وقت الهضم على إنتاجية الخلية ونسبة صلاحيتها. أدى وقت الهضم البالغ 20 دقيقة إلى تحقيق العائد الأمثل مع نسبة منخفضة من الخلايا البطانية غير القابلة للحياة.
أظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم اللاحق أن الخلايا البطانية المعزولة ظلت قابلة للحياة لمدة 60 دقيقة بعد العزل. تم تقييم نقاء عدد الخلايا من خلال تحليل PCR الكمي أو qPCRR للتعبير عن جينات الخلايا البطانية التي تظهر إثراء قويا لجينات الخلايا البطانية في مجموعة CD31 + CD45. تنقية الحمض النووي الريبي من الخلايا البطانية المعزولة تحويل وتضخيم cDNA من خلال إعداد المكتبة وتسلسلها أسفرت مكتبة cDNA عن أكثر من 16،000 جين تم تحديدها في تسع عينات مستقلة.
لوحظ انخفاض في النصوص لكل مليون قراءة أو TPM في الجينات التي تقل عن هذه العتبة. أدى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للخلايا البطانية الشبكية المعزولة من خلال خط أنابيب الجينوم 10x إلى متوسط 1،171 جينا لكل خلية ، و 15،247 جينا إجماليا مكتشفا ، ومتوسط 2،255 معرفا جزيئيا فريدا أو عدد UMI لكل خلية في 917 خلية. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي عزل أنسجة الشبكية وهضم الأنسجة ، والتي يجب إجراؤها بدقة كما هو موضح لتحسين إنتاجية الخلايا وصلاحيتها.
يمكن استخدام الخلايا البطانية المعزولة في تقنيات التسلسل المتقدمة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للنسخ الكامل ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وتسلسل الترسيب المناعي للكروماتين ، ومقايسة تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الطريقة المحسنة جنبا إلى جنب مع طرق التسلسل من الجيل التالي والنهج الحسابية إلى توضيح آليات مسارات الإشارات المترابطة التي تنظم تطورات الأوعية الدموية.
