שיטה זו של בידוד תאי אנדותל ברשתית תאפשר טכניקות ריצוף מתקדמות כדי לחשוף מנגנונים חדשים של התפתחות כלי הדם. הפרוטוקול המתואר ממוטב לדרגות גבוהות של כדאיות וטוהר, החיוניות ליישומי ריצוף מהדור הבא. מי שתדגים את ההליך תהיה שלבי קיין, סטודנטית לתואר שני ממעבדת הרשי.
התחל להסיר את העיניים מעכבר היילוד המומת על ידי חיתוך העור והקרום מעל העין עם חתך מאונך לעפעף באמצעות מספריים לנתיחה. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי ללחוץ כלפי מטה מעל ומתחת לעין, כך שהעין תזוז אל מחוץ לשקע. צובטים בזהירות מתחת לעין עם המלקחיים וחותכים את עצב הראייה שמחזיק את העין מחוברת.
לאחר מכן מניחים את שתי העיניים מהעכבר בבאר של צלחת 48 בארות ב- PBS הקר כקרח שהוכן טרי עד לסיום הקציר. כדי לבודד רקמת רשתית של עכבר, השהה את העיניים בכרית הדיסקציה בצלחת פטרי מלאה ב-500 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח באמצעות כרית צינור העברה עם קצה רחב. עובדים תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, מחזיקים את עצב הראייה עם מלקחיים עדינים אחד ומשתמשים במלקחיים השניים כדי לחדור את החור דרך החדר הקדמי של העין שבו הקרנית והסקלרה מתחברות.
לאחר מכן קרעו את החור במעגל בערך 75% מהדרך סביב הקרנית. בעת החזקת עצב הראייה עם מלקחיים אחד, השתמש במלקחיים השניים כדי לקרוע בעדינות את הסקלרה ואת הגוף הזגוגי מרקמת הרשתית. כדי להסיר את כלי העדשה ואת כלי מקלעת ההיאלואיד, יש להגיע לתוך הרשתית עם מלקחיים פתוחים עד שכמעט נוגעים בה ואז לסגור את המלקחיים כדי לתפוס ולמשוך את העדשה ואת כלי מקלעת ההיאלואיד החוצה מהרשתית.
כאשר כל כלי הדם מוסרים, מניחים את הרשתיות בשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה מיליליטר מלאים 500 מיקרוליטר של אחד x קר כקרח PBS. הסר עודפי PBS מצינור המיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר עם פיפטה המותירה כ -100 מיקרוליטרים של PBS בצינור כדי לכסות לחלוטין את רקמת הרשתית. לאחר מכן להוסיף 500 microliters של פתרון העיכול מוכן טרי לצינור.
השתמש בפיפטה P1000 ובקצה פיפטה כדי לבצע פיפטה במעלה ובמורד רקמת הרשתית בתמיסת העיכול חמש פעמים. בסיום, דגרו את תערובת העיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כאשר תערובת העיכול מעלה ומטה כל חמש דקות כפי שהוסבר קודם. לאחר הדגירה, רקמת הרשתית תתמוסס לתרחיף של תא בודד ותהפוך את תערובת העיכול לעכורה.
לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 375g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הסר את ה- PBS מכדור התא השטוף על ידי פיפטינג ולאחר מכן אימונוסטין התאים על ידי החייאת הכדור ב -100 מיקרוליטרים של תמיסת צביעת נוגדנים לכל 0.5 כפול 10 לתאים השישיים. דגרו את תרחיף התא הבודד עם תמיסת צביעת הנוגדנים במשך 30 דקות על קרח בחושך עם הקשה על הצינור כל 10 דקות כדי לערבב בעדינות את התאים.
למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-375 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת supernatant, לשטוף ו pellet את התאים ב 500 microliters של PBS כפי שתואר קודם. ואז לתלות את התאים ב-300 מיקרוליטרים של מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה או חיץ FACS על ידי ערבוב עדין עם הפיפטה.
לאחר מכן, הוסף פרופידיום יודיד או PI כסמן כדאיות לצינורות הדגימה המכילים את מאגר FACS כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. השתמש בפיפטה כדי להעביר את מתלי התאים דרך מכסה הצמדה של מסננת תאים המכיל מסנן 35 מיקרון לתוך מבחנה של חמישה מיליליטר. לאחר הסינון, שמור את צינור FACS על קרח בחושך ולאחר מכן העבר את הצינור לממיין התאים.
הפעל את מכשיר ה-FACS ואת המחשב ופתח את תוכנת FACS כדי להפעיל ולהפעיל את מכשיר ה-FACS. בצע בדיקות בקרת איכות שגרתיות. טען את דגימות כתם הבקרה למכשיר FACS כדי להתאים את הצירים.
התחל עם נוגדן IgG רק תאים כדי ליצור ולהתאים פיזור קדימה ופיזור צד. ואז נוגדן CD31 רק כדי ליצור ולהתאים CD31. ואז נוגדן CD45 רק כדי ליצור ולהתאים CD45.
הקלט את הנתונים מדוגמאות הפקד. לאחר מכן, טען את תאי הדגימה המוכתמים במכשיר FACS והפעל את הדגימה. החלף את התאים בהתבסס על פיזור קדימה או FSC ופרמטרים של פיזור צד או SSC.
תאי הליכה של FSCA ו- FSCH כדי לזהות כפילי תאים ולאסוף רק תאים בודדים. תאי הליכה על ידי PI ו- SSCA לזיהוי תאים בני קיימא. צור CD31+CD45-gait עם פקדים צור CD31+CD45-הליכה עם פקדים והליכה של התאים על-ידי CD31 ו-CD45.
הכנס צינור איסוף עם 250 מיקרוליטר של חיץ FACS במכשיר. לאחר מכן, התחל למיין תאים שהם CD31+CD45-לתוך צינור האיסוף המותקן. שמור את צינורות האיסוף על קרח לניתוח נוסף.
ניתן לעבד את הדוגמאות עבור יישומי ריצוף מהדור הבא. במחקר, שינוי זמן העיכול השפיע על תפוקת התאים ואחוז הכדאיות. זמן העיכול של 20 דקות הביא לתפוקה אופטימלית עם אחוז נמוך של תאי אנדותל שאינם בני קיימא.
צביעת פרופידיום יודיד מאוחרת יותר הראתה שתאי האנדותל המבודדים נשארו בני קיימא במשך 60 דקות לאחר הבידוד. טוהר אוכלוסיית התאים הוערך על ידי ניתוח כמותי של PCR או qPCRR של ביטוי גנים של תאי אנדותל שהראו העשרה חזקה לגנים של תאי אנדותל באוכלוסיית CD31+CD45. טיהור RNA מתאי האנדותל המבודדים המרה והגברת cDNA באמצעות הכנה וריצוף של הספרייה ספריית cDNA הביאה ליותר מ -16, 000 גנים שזוהו בתשע דגימות עצמאיות.
נצפתה ירידה בתעתיקים למיליון קריאות או TPM בגנים מתחת לסף זה. ריצוף הרנ"א החד-תאי של תאי האנדותל ברשתית המבודדים דרך צינור 10x Genomics הביא לחציון של 1, 171 גנים לתא, 15, 247 גנים בסך הכל שזוהו, וחציון של 2, 255 מזהים מולקולריים ייחודיים או ספירת UMI לכל תא ב-917 תאים. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם בידוד רקמת הרשתית ועיכול רקמות, אשר יש לבצע במדויק כמתואר כדי לייעל את תפוקת התאים ואת הכדאיות.
ניתן להשתמש בתאי האנדותל המבודדים בטכניקות ריצוף מתקדמות כגון ריצוף RNA שלם-תעתיק, ריצוף RNA של תא בודד, ריצוף מיצוי חיסוני של כרומטין, ובדיקה לריצוף כרומטין נגיש לטרנספוזאז. השימוש בשיטה אופטימלית זו בשילוב עם שיטות ריצוף מהדור הבא ועל ידי גישות חישוביות יכול להבהיר עוד יותר את המנגנונים של מסלולי איתות מחוברים המווסתים את התפתחות כלי הדם.
