網膜内皮細胞単離のこの方法は、血管発生の新しいメカニズムを明らかにするための高度なシーケンシング技術を可能にします。記載されているプロトコルは、次世代シーケンシングアプリケーションに不可欠な高レベルの実行可能性と純度に最適化されています。手順を実演するのは、ハーシー研究所の大学院生であるシェルビー・ケインです。
解剖ハサミを使用してまぶたを垂直に切開して目の上の皮膚と膜を切り取ることにより、安楽死させた新生児マウスから目の除去を開始します。次に、鉗子を使用して目の上下を押し下げ、目がソケットから出るようにします。鉗子で目の下を慎重につまみ、目をくっつけたままの視神経を切断します。
次に、マウスからの両眼を、収穫が終了するまで、新たに調製した氷冷PBSの48ウェルプレートのウェルに入れます。マウス網膜組織を単離するには、先端の広いトランスファーパイプパッドを使用して、500マイクロリットルの氷冷PBSで満たされたペトリ皿の解剖パッドに目を吊り下げます。解剖顕微鏡下で作業し、1つの細かい鉗子で視神経を保持し、2番目の鉗子を使用して、角膜と強膜が接続する目の前房に穴を開けます。
次に、角膜の周りの約75%の円で穴を引き裂きます。1つの鉗子で視神経を保持しながら、2番目の鉗子を使用して、強膜と硝子体を網膜組織からそっと引き裂きます。水晶体と腌骨神経叢の血管を取り除くには、開いた鉗子で網膜に手を伸ばし、ほとんど触れるまで網膜に手を伸ばし、次に鉗子を閉じて水晶体と顎骨神経叢の血管をつかんで網膜から引き出します。
すべての血管を取り外したら、500マイクロリットルの氷冷PBS1本で満たされた2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに網膜を入れます。2ミリリットルの微量遠心チューブから余分なPBSをピペットで取り除き、チューブ内に約100マイクロリットルのPBSを残して網膜組織を完全に覆います。次に、500マイクロリットルの新たに調製した消化溶液をチューブに加えます。
P1000ピペッタとピペットチップを使用して、消化液中の網膜組織を5回ピペットで上下させます。完了したら、前に説明したように、消化混合物を摂氏37度の水浴で20分間インキュベートし、消化混合物を5分ごとに上下にピペッティングします。インキュベーション後、網膜組織は単一の細胞懸濁液に溶解し、消化混合物を濁らせます。
次に、摂氏4度で5分間375gで遠心分離することにより細胞をペレット化した。遠心分離後、ピペッティングにより洗浄した細胞ペレットからPBSを取り出し、次いで該ペレットを100マイクロリットルの抗体染色液あたり10〜6番目の細胞に0.5倍再懸濁して細胞を免疫染色する。単一細胞懸濁液を抗体染色溶液とともに氷上で30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを軽くたたいて細胞を穏やかに混合します。
蛍光活性化細胞選別では、375gで4°Cで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去した後、細胞を洗浄し、前述のように500マイクロリットルのPBSでペレット化する。次いで、ピペッタと穏やかに混合することにより300マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別またはFACS緩衝液に細胞を再懸濁する。
次に、FACSバッファーを含むサンプルチューブに生存マーカーとしてヨウ化プロピジウムまたはPIを添加し、ミリリットルあたり0.5マイクログラムの最終濃度を取得します。ピペットを使用して、35ミクロンのフィルターが入ったセルストレーナースナップキャップを通して細胞懸濁液を5ミリリットルの試験管に移します。ろ過後、FACSチューブを暗所で氷上に保ち、チューブをセルソーターに移します。
FACS機器とコンピュータの電源を入れ、FACSソフトウェアを開いてFACS機器を実行および操作します。定期的な品質管理テストを実行します。コントロール染色サンプルをFACS装置にロードして、軸を調整します。
IgG抗体のみの細胞から始めて、前方散乱と側方散乱を生成および調整します。次にCD31抗体のみをCD31を生成・調整する。そしてCD45抗体のみを生成・調整する。
対照サンプルからのデータを記録します。次に、染色したサンプル細胞をFACS装置にロードし、サンプルを実行します。前方散乱またはFSCおよび側方散乱またはSSCパラメータに基づいて細胞を歩行します。
FSCAとFSCHによって細胞を歩き、細胞ダブレットを識別し、単一細胞のみを収集します。PIおよびSSCAにより細胞を歩行し、生細胞を同定する。コントロールでCD31 + CD45歩行を行うコントロールでCD31 + CD45歩行を行い、CD31とCD45で細胞を歩行します。
250マイクロリットルのFACSバッファーが入った収集チューブを機器に挿入します。次に、CD31 + CD45である細胞を、取り付けられた収集チューブに分類し始めます。さらなる分析のために、収集チューブを氷の上に置いてください。
サンプルは、次世代シーケンシングアプリケーション用に処理できます。この研究では、消化時間を変えると、細胞収量と生存率に影響しました。20分の消化時間は、生存不能な内皮細胞の割合が低い状態で最適な収量をもたらしました。
その後のヨウ化プロピジウム染色は、単離された内皮細胞が単離後60分間生存し続けることを実証した。細胞集団の純度は、CD31+CD45集団における内皮細胞遺伝子の強い濃縮を示す内皮細胞遺伝子の発現の定量的PCRまたはqPCR分析によって評価した。単離された内皮細胞からのRNAの精製 ライブラリ調製およびシーケンシングによるcDNAの変換および増幅 cDNAライブラリは、9つの独立したサンプルで同定された16, 000を超える遺伝子をもたらしました。
100万リードあたりの転写物の低下またはTPMは、この閾値を下回る遺伝子で観察されました。10x Genomicsパイプラインを介した単離された網膜内皮細胞のシングルセルRNAシーケンシングは、917細胞において細胞当たり1, 171遺伝子の中央値、15, 247個の全遺伝子が検出され、および中央値2, 255個の細胞当たりの一意の分子識別子またはUMIカウントをもたらした。このプロトコルの重要なステップは、網膜組織の分離と組織消化であり、細胞収量と生存率を最適化するために、説明されているように正確に実行する必要があります。
単離された内皮細胞は、全トランスクリプトームRNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシング、クロマチン免疫沈降シーケンシング、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンシーケンシングのアッセイなどの高度なシーケンシング技術に使用できます。この最適化された手法を次世代シーケンシング法と組み合わせ、計算論的アプローチと組み合わせることで、血管の発達を制御する相互接続されたシグナル伝達経路のメカニズムをさらに解明することができます。
