这种视网膜内皮细胞分离方法将允许先进的测序技术来揭示血管发育的新机制。所述方案针对高活性和纯度进行了优化，这对于下一代测序应用至关重要。展示该程序的是Hershey实验室的研究生Shelby Cain。
通过使用解剖剪刀切掉眼睛上的皮肤和膜，垂直于眼睑切开，开始从安乐死的新生小鼠身上去除眼睛。然后用镊子向下按压眼睛上方和下方，使眼睛移出眼窝。用镊子小心地捏住眼睛下方，并切断保持眼睛附着的视神经。
然后将小鼠的两只眼睛放在新鲜制备的冰冷PBS中的48孔板的孔中，直到完成收获。为了分离小鼠视网膜组织，使用具有宽尖端的转移管垫将眼睛悬浮在装有500微升冰冷PBS的培养皿中的解剖垫中。在解剖显微镜下工作，用一个细镊子握住视神经，然后用第二个镊子穿过角膜和巩膜连接的眼睛前房的孔。
然后在角膜周围大约 75% 处将孔撕成一个圆圈。用一个镊子握住视神经时，用第二个镊子轻轻地将巩膜和玻璃体从视网膜组织上撕下来。要去除晶状体和透明体丛血管，请用张开的镊子伸入视网膜，直到几乎接触它，然后关闭镊子以抓住晶状体和透明体丛血管并将其从视网膜中拉出。
当所有血管都被移除时，将视网膜放入装有500微升一个x冰冷PBS的两毫升微量离心管中。用移液管从两毫升微量离心管中取出多余的PBS，在管中留下约100微升PBS，以完全覆盖视网膜组织。然后将500微升新鲜制备的消化溶液加入管中。
使用 P1000 移液器和移液器吸头在消化液中上下移液视网膜组织五次。完成后，将消化混合物在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟，如前所述每五分钟上下移液一次消化混合物。孵育后，视网膜组织将溶解成单细胞悬液，使消化混合物变得浑浊。
接下来，通过在 375g 下在 4 摄氏度下离心五分钟来沉淀细胞。离心后，通过移液从洗涤的细胞沉淀中除去PBS，然后通过将沉淀重悬于每0.5乘以10的100微升抗体染色溶液中对细胞进行免疫染色，每6个细胞乘以10。将单细胞悬液与抗体染色溶液在黑暗中的冰上孵育30分钟，每10分钟敲击试管以轻轻混合细胞。
对于荧光激活细胞分选，通过在 375g 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟来沉淀细胞。除去上清液后，如前所述在500微升PBS中洗涤和沉淀细胞。然后通过与移液管轻轻混合，将细胞重悬于300微升荧光激活细胞分选或FACS缓冲液中。
接下来，将碘化丙啶或PI作为活性标记物添加到含有FACS缓冲液的样品管中，以获得每毫升0.5微克的最终浓度。使用移液器将细胞悬液通过含有35微米过滤器的细胞过滤器卡扣盖转移到5毫升试管中。过滤后，将FACS管放在黑暗中的冰上，然后将管转移到细胞分选机上。
打开 FACS 仪器和计算机，打开 FACS 软件以运行和操作 FACS 仪器。执行常规质量控制测试。将对照染色样品加载到 FACS 仪器中以调整轴。
从仅IgG抗体细胞开始，以产生和调整前向散射和侧向散射。然后CD31抗体只产生和调节CD31。然后CD45抗体只产生和调节CD45。
记录对照样品中的数据。接下来，将染色的样品池加载到 FACS 仪器中并运行样品。根据前向散射或FSC和侧向散射或SSC参数对细胞进行步态。
通过FSCA和FSCH对步态细胞进行识别，仅收集单个细胞。通过PI和SSCA对步态细胞进行识别活细胞。用对照制作CD31 + CD45步态 用对照制作CD31 + CD45步态，并通过CD31和CD45步态细胞。
在仪器中插入装有 250 微升 FACS 缓冲液的收集管。接下来，开始将CD31 + CD45的细胞分选到已安装的收集管中。将收集管放在冰上以进行进一步分析。
这些样品可以用于下一代测序应用。在研究中，改变消化时间会影响细胞产量和活力百分比。20分钟的消化时间导致最佳产量，非活内皮细胞的百分比低。
随后的碘化丙啶染色表明，分离的内皮细胞在分离后保持活力60分钟。通过定量PCR或qPCRR分析评估细胞群纯度，显示CD31 + CD45群体中内皮细胞基因的表达具有很强的富集性。从分离的内皮细胞中纯化RNA，通过文库制备和测序转换和扩增cDNA cDNA文库在9个独立样本中鉴定出超过16， 000个基因。
在低于该阈值的基因中观察到每百万次读数或TPM的转录本下降。通过 10x Genomics 管道对分离的视网膜内皮细胞进行单细胞 RNA 测序，每个细胞的中位数为 1， 171 个基因，检测到的总基因为 15， 247 个，917 个细胞中每个细胞的中位数为 2， 255 个唯一分子标识符或 UMI 计数。该协议中的关键步骤是视网膜组织分离和组织消化，应按照描述准确执行以优化细胞产量和活力。
分离的内皮细胞可用于先进的测序技术，例如全转录组RNA测序，单细胞RNA测序，染色质免疫沉淀测序以及转座酶可及染色质测序的测定。将这种优化的方法与下一代测序方法和计算方法结合使用，可以进一步阐明调节血管发育的互连信号通路的机制。
