Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken. Das beschriebene Protokoll ist für hohe Lebensfähigkeit und Reinheit optimiert, die für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation unerlässlich sind. Das Verfahren wird von Shelby Cain, einem Doktoranden des Hershey Laboratory, demonstriert.
Beginnen Sie, die Augen von der euthanasierten Neugeborenenmaus zu entfernen, indem Sie die Haut und die Membran über dem Auge mit einem senkrechten Schnitt zum Augenlid mit einer Sezierschere abschneiden. Verwenden Sie dann die Pinzette, um über und unter das Auge zu drücken, so dass sich das Auge aus der Augenhöhle bewegt. Kneifen Sie vorsichtig mit der Pinzette unter das Auge und schneiden Sie den Sehnerv, der das Auge befestigt hält.
Dann legen Sie beide Augen der Maus bis zur Ernte in eine Vertiefung der 48-Well-Platte im frisch zubereiteten eiskalten PBS. Um das Netzhautgewebe der Maus zu isolieren, hängen Sie die Augen in der Präparierplatte in einer Petrischale auf, die mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBS gefüllt ist, indem Sie ein Transferrohrpad mit breiter Spitze verwenden. Arbeiten Sie unter dem Dissektionsmikroskop, halten Sie den Sehnerv mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie die zweite Pinzette, um das Loch durch die Vorderkammer des Auges zu stechen, wo sich Hornhaut und Sklera verbinden.
Dann reißen Sie das Loch in einem Kreis etwa 75% des Weges um die Hornhaut. Während Sie den Sehnerv mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Sklera und den Glaskörper sanft vom Netzhautgewebe abzureißen. Um Linsen- und Hyaloidplexusgefäße zu entfernen, greifen Sie mit einer offenen Pinzette in die Netzhaut, bis Sie sie fast berühren, und schließen Sie dann die Pinzette, um die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße aus der Netzhaut zu greifen und herauszuziehen.
Wenn alle Gefäße entfernt sind, legen Sie die Netzhaut in die zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die mit 500 Mikrolitern eines x eiskaltem PBS gefüllt sind. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus dem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, wobei etwa 100 Mikroliter PBS in der Röhre verbleiben, um das Netzhautgewebe vollständig zu bedecken. Dann 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Aufschlusslösung in das Röhrchen geben.
Verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipettenspitze, um das Netzhautgewebe in der Verdauungslösung fünfmal auf und ab zu pipettieren. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie die Verdauungsmischung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 20 Minuten, wobei die Verdauungsmischung alle fünf Minuten auf und ab pipettiert wird, wie zuvor beschrieben. Nach der Inkubation löst sich das Netzhautgewebe in eine einzellige Suspension auf, wodurch die Verdauungsmischung trüb wird.
Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation das PBS aus dem gewaschenen Zellpellet durch Pipettieren entfernen und dann die Zellen immunfärben, indem Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Antikörperfärbelösung pro 0,5 mal 10 zu den sechsten Zellen resuspendieren. Inkubieren Sie die einzellige Suspension mit der Antikörperfärbelösung für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln, indem Sie alle 10 Minuten auf das Röhrchen klopfen, um die Zellen vorsichtig zu mischen.
Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands waschen und pelletieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben in 500 Mikrolitern PBS. Und dann resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikroliter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer durch vorsichtiges Mischen mit der Pipette.
Als nächstes fügen Sie Propidiumiodid oder PI als Lebensfähigkeitsmarker zu den Probenröhrchen hinzu, die den FACS-Puffer enthalten, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspensionen durch eine Schnappkappe des Zellsiebs, die einen 35-Mikron-Filter enthält, in ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas zu überführen. Nach der Filtration halten Sie das FACS-Rohr im Dunkeln auf Eis und übergeben Sie das Röhrchen dann in den Zellsortierer.
Schalten Sie das FACS-Instrument und den Computer ein und öffnen Sie die FACS-Software, um das FACS-Instrument auszuführen und zu bedienen. Führen Sie routinemäßige Qualitätskontrolltests durch. Legen Sie die Kontrollfleckenproben in das FACS-Instrument, um die Achsen anzupassen.
Beginnen Sie mit reinen IgG-Antikörperzellen, um Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung zu erzeugen und anzupassen. Dann CD31-Antikörper nur, um CD31 zu erzeugen und anzupassen. Und dann CD45-Antikörper nur, um CD45 zu erzeugen und anzupassen.
Notieren Sie die Daten aus den Kontrollproben. Als nächstes laden Sie die gefärbten Probenzellen in das FACS-Instrument und führen die Probe aus. Gang der Zellen basierend auf Vorwärtsstreuung oder FSC und Seitenstreuung oder SSC-Parametern.
Gangzellen von FSCA und FSCH zur Identifizierung von Zelldubletten und zur Entnahme von nur Einzelzellen. Gangzellen durch PI und SSCA zur Identifizierung lebensfähiger Zellen. Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen und gehen Sie die Zellen mit CD31 und CD45.
Führen Sie ein Sammelröhrchen mit 250 Mikrolitern FACS-Puffer in das Gerät ein. Als nächstes beginnen Sie mit der Sortierung von Zellen CD31+CD45 in das installierte Sammelrohr. Bewahren Sie die Sammelröhrchen zur weiteren Analyse auf Eis auf.
Die Proben können für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation aufbereitet werden. In der Studie beeinflusste die Variation der Verdauungszeit den Zellertrag und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit. Die Verdauungszeit von 20 Minuten führte zu einer optimalen Ausbeute mit einem geringen Anteil an nicht lebensfähigen Endothelzellen.
Die anschließende Propidiumiodid-Färbung zeigte, dass die isolierten Endothelzellen nach der Isolierung 60 Minuten lang lebensfähig blieben. Die Reinheit der Zellpopulation wurde durch quantitative PCR- oder qPCRR-Analyse der Expression von Endothelzellgenen bewertet, die eine starke Anreicherung für Endothelzellgene in der CD31+CD45-Population zeigten. Reinigung von RNA aus den isolierten Endothelzellen, die cDNA durch Bibliothekspräparation und Sequenzierung umwandeln und amplifizieren Die cDNA-Bibliothek führte zu mehr als 16.000 Genen, die in neun unabhängigen Proben identifiziert wurden.
Ein Abfall der Transkripte pro Million Lesevorgänge oder TPM wurde in Genen unterhalb dieser Schwelle beobachtet. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung der isolierten retinalen Endothelzellen durch die 10x Genomics-Pipeline führte zu einem Median von 1.171 Genen pro Zelle, 15.247 nachgewiesenen Genen und einem Median von 2.255 eindeutigen molekularen Identifikatoren oder UMI-Zählungen pro Zelle in 917 Zellen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Netzhautgewebeisolierung und die Gewebeverdauung, die genau wie beschrieben durchgeführt werden sollten, um den Zellertrag und die Lebensfähigkeit zu optimieren.
Die isolierten Endothelzellen können in fortgeschrittenen Sequenzierungstechniken wie der Ganztranskriptom-RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung und Assay für Transposase-zugängliche Chromatinsequenzierung verwendet werden. Der Einsatz dieser optimierten Methode in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierungsmethoden und durch computergestützte Ansätze kann die Mechanismen miteinander verbundener Signalwege, die vaskuläre Entwicklungen regulieren, weiter aufklären.
