Este método de isolamento das células endoteliais da retina permitirá técnicas avançadas de sequenciamento para revelar novos mecanismos de desenvolvimento vascular. O protocolo descrito é otimizado para altos graus de viabilidade e pureza, que são essenciais para aplicações de sequenciamento de próxima geração. Demonstrando o procedimento estará Shelby Cain, uma estudante de pós-graduação do Laboratório Hershey.
Comece a remover os olhos do rato neonatal eutanasiado cortando a pele e a membrana sobre o olho com uma incisão perpendicular à pálpebra usando uma tesoura de dissecação. Em seguida, use a pinça para pressionar acima e abaixo do olho para que o olho se mova para fora da órbita. Aperte cuidadosamente sob o olho com a pinça e corte o nervo óptico que mantém o olho ligado.
Em seguida, coloque os dois olhos do rato em um poço da placa de 48 poços no PBS gelado recém-preparado até terminar a colheita. Para isolar o tecido da retina do rato, suspenda os olhos na almofada de dissecação numa placa de Petri preenchida com 500 microlitros de PBS gelado utilizando uma almofada de tubo de transferência com uma ponta larga. Trabalhando sob o microscópio de dissecção, segure o nervo óptico com uma pinça fina e use a segunda pinça para perfurar o orifício através da câmara anterior do olho, onde a córnea e a esclera se conectam.
Em seguida, rasgue o buraco em um círculo de cerca de 75% do caminho ao redor da córnea. Ao segurar o nervo óptico com uma pinça, use a segunda pinça para rasgar suavemente a esclera e o corpo vítreo do tecido da retina. Para remover a lente e os vasos do plexo hialoide, alcance a retina com pinça aberta até quase tocá-la e, em seguida, feche a pinça para agarrar e puxar a lente e os vasos do plexo hialoide para fora da retina.
Quando todos os vasos forem removidos, coloque as retinas nos tubos microcentrífugos de dois mililitros preenchidos com 500 microlitros de um PBS gelado x gelado. Remova o excesso de PBS do tubo microcentrífugo de dois mililitros com uma pipeta deixando cerca de 100 microlitros de PBS no tubo para cobrir completamente o tecido da retina. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de digestão recém-preparada ao tubo.
Use uma pipeta P1000 e uma ponta de pipeta para pipetar para cima e para baixo o tecido da retina na solução de digestão cinco vezes. Quando terminar, incube a mistura de digestão em banho-maria de 37 graus Celsius por 20 minutos com pipetagem da mistura de digestão para cima e para baixo a cada cinco minutos, conforme explicado anteriormente. Após a incubação, o tecido da retina se dissolverá em uma única suspensão celular, tornando a mistura de digestão turva.
Em seguida, pellet as células por centrifugação a 375g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o PBS do pellet de células lavadas por pipetagem e, em seguida, imunomarize as células ressuspendendo o pellet em 100 microlitros de solução de coloração de anticorpos por 0,5 vezes 10 até as sextas células. Incubar a suspensão de célula única com a solução de coloração de anticorpos durante 30 minutos sobre gelo no escuro com batidas no tubo a cada 10 minutos para misturar suavemente as células.
Para a classificação de células ativadas por fluorescência, pellet as células por centrifugação a 375g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, lave e coloque as células em 500 microlitros de PBS, conforme descrito anteriormente. E, em seguida, ressuspenda as células em 300 microlitros de classificação celular ativada por fluorescência ou tampão FACS misturando suavemente com a pipetta.
Em seguida, adicione iodeto de propídio ou PI como um marcador de viabilidade aos tubos de amostra contendo o tampão FACS para obter uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro. Use uma pipeta para transferir as suspensões celulares através de uma tampa de encaixe de filtro de células contendo um filtro de 35 mícrons em um tubo de ensaio de cinco mililitros. Após a filtração, mantenha o tubo FACS no gelo no escuro e, em seguida, transfira o tubo para o classificador de células.
Ligue o instrumento FACS e o computador e abra o software FACS para executar e operar o instrumento FACS. Realizar testes de controle de qualidade de rotina. Carregue as amostras de mancha de controle no instrumento FACS para ajustar os eixos.
Comece com células apenas de anticorpos IgG para gerar e ajustar a dispersão para a frente e a dispersão lateral. Em seguida, o anticorpo CD31 apenas para gerar e ajustar o CD31. E, em seguida, o anticorpo CD45 apenas para gerar e ajustar o CD45.
Registre os dados das amostras de controle. Em seguida, carregue as células de amostra coradas no instrumento FACS e execute a amostra. Marchar as células com base em parâmetros de dispersão para frente ou FSC e dispersão lateral ou SSC.
Células de marcha por FSCA e FSCH para identificar duplicatas celulares e coletar apenas células únicas. Células de marcha por PI e SSCA para identificar células viáveis. Faça uma marcha CD31+CD45 com controles Faça uma marcha CD31+CD45 com controles e marche as células por CD31 e CD45.
Insira um tubo de coleta com 250 microlitros de tampão FACS no instrumento. Em seguida, comece a classificar as células que são CD31 + CD45 no tubo de coleta instalado. Mantenha os tubos de coleta no gelo para uma análise mais aprofundada.
As amostras podem ser processadas para aplicativos de sequenciamento de próxima geração. No estudo, a variação do tempo de digestão afetou o rendimento celular e a porcentagem de viabilidade. O tempo de digestão de 20 minutos resultou em um rendimento ótimo com uma baixa porcentagem de células endoteliais não viáveis.
A coloração subsequente com iodeto de propídio demonstrou que as células endoteliais isoladas permaneceram viáveis por 60 minutos após o isolamento. A pureza da população celular foi avaliada por análise quantitativa de PCR ou qPCRR da expressão de genes de células endoteliais mostrando forte enriquecimento para genes de células endoteliais na população CD31+CD45. Purificação do RNA das células endoteliais isoladas convertendo e amplificando o cDNA através da preparação e sequenciamento da biblioteca A biblioteca de cDNA resultou em mais de 16.000 genes identificados em nove amostras independentes.
Uma queda nos transcritos por milhão de leituras ou TPM foi observada em genes abaixo desse limiar. O sequenciamento de RNA de célula única das células endoteliais isoladas da retina através do pipeline 10x Genomics resultou em uma mediana de 1.171 genes por célula, 15.247 genes totais detectados e uma mediana de 2.255 identificadores moleculares únicos ou contagens UMI por célula em 917 células. As etapas críticas neste protocolo são o isolamento tecidual da retina e a digestão tecidual, que devem ser realizados com precisão, conforme descrito, para otimizar o rendimento e a viabilidade celular.
As células endoteliais isoladas podem ser usadas em técnicas avançadas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro, sequenciamento de RNA de célula única, sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina e ensaio para sequenciamento de cromatina acessível à transposase. O uso desse método otimizado em combinação com métodos de sequenciamento de próxima geração e por abordagens computacionais pode elucidar ainda mais os mecanismos de vias de sinalização interconectadas que regulam os desenvolvimentos vasculares.
