Bu retinal endotel hücre izolasyonu yöntemi, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını ortaya çıkarmak için ileri dizileme tekniklerine izin verecektir. Açıklanan protokol, yeni nesil dizileme uygulamaları için gerekli olan yüksek derecede canlılık ve saflık için optimize edilmiştir. Prosedürü gösteren, Hershey Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi olan Shelby Cain olacak.
Diseksiyon makası kullanarak göz kapağına dik bir kesi ile göz üzerindeki cildi ve zarı keserek ötenazi yenidoğan faresinden gözleri çıkarmaya başlayın. Ardından, gözün soketten dışarı çıkması için gözün üstüne ve altına bastırmak için forsepsleri kullanın. Forseps ile gözün altına dikkatlice sıkıştırın ve gözü bağlı tutan optik siniri kesin.
Ardından, farenin her iki gözünü de hasat bitene kadar taze hazırlanmış buz gibi PBS'deki 48 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Fare retina dokusunu izole etmek için, diseksiyon pedindeki gözleri, geniş uçlu bir transfer borusu pedi kullanarak 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş bir Petri kabında askıya alın. Diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, optik siniri bir ince forseps ile tutun ve ikinci forsepsleri, kornea ve skleranın bağlandığı gözün ön odasından deliği delmek için kullanın.
Daha sonra deliği, korneanın etrafındaki yolun yaklaşık% 75'inde bir daire içinde yırtın. Optik siniri bir forseps ile tutarken, sklerayı ve vitreus gövdesini retina dokusundan nazikçe yırtmak için ikinci forsepsleri kullanın. Lens ve hyaloid pleksus damarlarını çıkarmak için, neredeyse dokunana kadar açık forseps ile retinaya ulaşın ve ardından lensi ve hyaloid pleksus damarlarını retinadan tutup çekmek için forsepsleri kapatın.
Tüm damarlar çıkarıldığında, retinaları 500 mikrolitre bir x buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Retina dokusunu tamamen örtmek için tüpte yaklaşık 100 mikrolitre PBS bırakan bir pipetle iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünden fazla PBS'yi çıkarın. Daha sonra tüpe taze hazırlanmış sindirim çözeltisinden 500 mikrolitre ekleyin.
Sindirim solüsyonundaki retina dokusunu beş kez yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipet ve pipet ucu kullanın. Tamamlandığında, sindirim karışımını 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin ve sindirim karışımını daha önce açıklandığı gibi her beş dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. Kuluçkadan sonra, retina dokusu tek bir hücre süspansiyonunda çözülecek ve sindirim karışımını bulanıklaştıracaktır.
Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 375g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Santrifüjlemeyi takiben, PBS'yi yıkanmış hücre peletinden pipetle çıkarın ve daha sonra peleti altıncı hücrelere 0.5 kez 10 başına 100 mikrolitre antikor boyama çözeltisi içinde yeniden askıya alarak hücreleri immünostain. Tek hücreli süspansiyonu, hücreleri nazikçe karıştırmak için her 10 dakikada bir tüpe dokunarak karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca antikor boyama çözeltisi ile inkübe edin.
Floresan ile aktive edilen hücre sıralama için, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 375g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Süpernatan çıkarıldıktan sonra, hücreleri daha önce tarif edildiği gibi 500 mikrolitre PBS'de yıkayın ve toplayın. Daha sonra pipetta ile nazikçe karıştırarak hücreleri 300 mikrolitre floresan ile aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS tamponunda yeniden askıya alın.
Daha sonra, mililitre başına 0.5 mikrogramlık bir son konsantrasyon elde etmek için FACS tamponunu içeren numune tüplerine bir canlılık belirteci olarak propidium iyodür veya PI ekleyin. Hücre süspansiyonlarını, 35 mikronluk bir filtre içeren bir hücre süzgeci çıtçıtlı kapağından beş mililitrelik bir test tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Filtrelemeden sonra, FACS tüpünü karanlıkta buz üzerinde tutun ve ardından tüpü hücre sıralayıcısına aktarın.
FACS cihazını ve bilgisayarı açın ve FACS cihazını çalıştırmak ve çalıştırmak için FACS yazılımını açın. Rutin kalite kontrol testleri yapın. Eksenleri ayarlamak için kontrol lekesi numunelerini FACS cihazına yükleyin.
İleriye doğru saçılma ve yan saçılma oluşturmak ve ayarlamak için sadece IgG antikoru hücreleri ile başlayın. Daha sonra CD31 antikoru sadece CD31 üretmek ve ayarlamak için. Ve sonra CD45 antikoru sadece CD45 üretmek ve ayarlamak için.
Denetim örneklerinden verileri kaydedin. Ardından, lekeli numune hücrelerini FACS cihazına yükleyin ve numuneyi çalıştırın. Hücreleri ileri saçılma veya FSC ve yan saçılma veya SSC parametrelerine göre yürüyün.
FSCA ve FSCH tarafından hücre çiftlerini tanımlamak ve sadece tek hücreleri toplamak için yürüyüş hücreleri. Canlı hücreleri tanımlamak için PI ve SSCA ile yürüyüş hücreleri. Kontrollerle CD31 + CD45 yürüyüşü yapın Kontrollerle CD31 + CD45 yürüyüşü yapın ve hücreleri CD31 ve CD45 ile yürüyün.
Cihaza 250 mikrolitre FACS tamponu içeren bir toplama tüpü yerleştirin. Ardından, CD31+CD45 olan hücreleri yüklü toplama tüpüne sıralamaya başlayın. Daha fazla analiz için toplama tüplerini buz üzerinde tutun.
Numuneler yeni nesil dizileme uygulamaları için işlenebilir. Çalışmada, sindirim süresinin değiştirilmesi hücre verimini ve canlılık yüzdesini etkiledi. 20 dakikalık sindirim süresi, düşük oranda canlı olmayan endotel hücreleri ile optimal bir verim ile sonuçlandı.
Daha sonraki propidium iyodür boyaması, izole endotel hücrelerinin izolasyondan sonra 60 dakika boyunca canlı kaldığını göstermiştir. Hücre popülasyonu saflığı, CD31 + CD45 popülasyonundaki endotel hücre genleri için güçlü zenginleştirme gösteren endotel hücre genlerinin ekspresyonunun kantitatif PCR veya qPCRR analizi ile değerlendirildi. İzole endotel hücrelerinden RNA'nın saflaştırılması ve kütüphane hazırlama ve dizileme yoluyla cDNA'yı dönüştürmesi ve yükseltmesi cDNA kütüphanesi, dokuz bağımsız örnekte tanımlanan 16.000'den fazla gen ile sonuçlandı.
Bu eşiğin altındaki genlerde milyon okuma veya TPM başına transkriptlerde bir düşüş gözlendi. İzole edilmiş retinal endotel hücrelerinin 10x Genomik boru hattı boyunca tek hücreli RNA dizilimi, hücre başına 1.171 gen, tespit edilen 15.247 genin medyanı ve 917 hücrede hücre başına 2.255 benzersiz moleküler tanımlayıcı veya UMI sayımının medyanı ile sonuçlandı. Bu protokoldeki kritik adımlar, hücre verimini ve canlılığını optimize etmek için tarif edildiği gibi doğru bir şekilde yapılması gereken retinal doku izolasyonu ve doku sindirimidir.
İzole endotel hücreleri, tüm transkriptom RNA dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi, kromatin immünopresipitasyon dizilimi ve transpozaz erişimli kromatin dizilimi için tahlil gibi gelişmiş dizileme tekniklerinde kullanılabilir. Bu optimize edilmiş yöntemin yeni nesil dizileme yöntemleriyle ve hesaplamalı yaklaşımlarla birlikte kullanılması, vasküler gelişmeleri düzenleyen birbirine bağlı sinyal yollarının mekanizmalarını daha da açıklığa kavuşturabilir.
