Этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки позволит использовать передовые методы секвенирования для выявления новых механизмов развития сосудов. Описанный протокол оптимизирован для высоких степеней жизнеспособности и чистоты, которые необходимы для приложений секвенирования следующего поколения. Продемонстрировать процедуру будет Шелби Кейн, аспирант из лаборатории Херши.
Начните удалять глаза у усыпленной неонатальной мыши, отрезав кожу и мембрану над глазом перпендикулярным разрезом века с помощью ножниц для рассечения. Затем используйте щипцы, чтобы надавить сверху и ниже глаза, чтобы глаз двигался из гнезда. Осторожно зажмите под глаз щипцами и перережьте зрительный нерв, который держит глаз прикрепленным.
Затем поместите оба глаза мыши в колодец из 48-луночной тарелки в свежеприготовленный ледяной PBS до окончания сбора урожая. Чтобы изолировать ткань сетчатки мыши, подвешивайте глаза в подушечке для рассечения в чашке Петри, заполненной 500 микролитрами ледяного PBS, используя прокладку передаточной трубы с широким наконечником. Работая под рассеченным микроскопом, удерживайте зрительный нерв одним тонким щипцом и используйте вторые щипцы, чтобы проткнуть отверстие через переднюю камеру глаза, где соединяются роговица и склера.
Затем разорвите отверстие по кругу примерно на 75% пути вокруг роговицы. Удерживая зрительный нерв одним щипцом, используйте вторые щипцы, чтобы аккуратно оторвать склеру и стекловидное тело от ткани сетчатки. Чтобы удалить сосуды хрусталика и гиалоидного сплетения, доберитесь до сетчатки открытыми щипцами, пока почти не коснитесь ее, а затем закройте щипцы, чтобы схватить и вытащить сосуды хрусталика и подъязычно-подвздошного сплетения из сетчатки.
Когда все сосуды удалены, поместите сетчатку в двух миллилитровые микроцентрифужные трубки, заполненные 500 микролитрами одного x ледяного PBS. Удалите избыток PBS из двухмиллитровой микроцентрифужной трубки с помощью пипетки, оставив около 100 микролитров PBS в трубке, чтобы полностью покрыть ткань сетчатки. Затем добавьте в тюбик 500 микролитров свежеприготовленного раствора для пищеварения.
Используйте пипетту P1000 и наконечник пипетки для пипетки вверх и вниз по ткани сетчатки в растворе для пищеварения пять раз. Когда это будет сделано, инкубируйте смесь для пищеварения на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия в течение 20 минут с пипеткой смеси для пищеварения вверх и вниз каждые пять минут, как объяснялось ранее. После инкубации ткань сетчатки растворится в одноклеточную суспензию, делая смесь пищеварения мутной.
Затем гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования удаляют PBS из промытой клеточной гранулы путем пипетирования, а затем иммунорафинируют клетки путем повторного использования гранулы в 100 микролитрах раствора для окрашивания антител на 0,5 раза 10 до шестых клеток. Инкубируйте одноклеточную суспензию с раствором для окрашивания антител в течение 30 минут на льду в темноте, постукивая по трубке каждые 10 минут, чтобы аккуратно перемешать клетки.
Для флуоресцентно-активированной сортировки клеток гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта промыть и гранулировать клетки в 500 микролитров PBS, как описано ранее. А затем повторно суспендировать ячейки в 300 микролитрах флуоресцентно-активированной сортировки клеток или буфера FACS, осторожно смешивая с пипеттой.
Затем добавьте йодид пропидия или PI в качестве маркера жизнеспособности в пробирки, содержащие буфер FACS, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 микрограмма на миллилитр. Используйте пипетку для переноса клеточных суспензий через защелкивающийся колпачок клеточного сетчатого фильтра, содержащий 35-микронный фильтр, в пятимиллилитровую пробирку. После фильтрации держите трубку FACS на льду в темноте, а затем перенесите трубку в сортировщик ячеек.
Включите прибор FACS и компьютер и откройте программное обеспечение FACS для запуска и эксплуатации прибора FACS. Выполняйте регулярные тесты контроля качества. Загрузите контрольные образцы пятен в прибор FACS для регулировки осей.
Начните с клеток только с антител IgG, чтобы генерировать и корректировать прямое рассеяние и боковое рассеяние. Затем антитело CD31 только для генерации и корректировки CD31. А затем антитело CD45 только для генерации и настройки CD45.
Запишите данные из контрольных образцов. Затем загрузите окрашенные ячейки образца в инструмент FACS и запустите образец. Походка по ячейкам на основе параметров прямого рассеяния или FSC и бокового рассеяния или SSC.
Клетки походки FSCA и FSCH для идентификации дублетов клеток и сбора только одиночных клеток. Клетки походки по PI и SSCA для идентификации жизнеспособных клеток. Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления и походку по клеткам CD31 и CD45.
Вставьте в прибор коллекторную трубку с 250 микролитрами буфера FACS. Затем начните сортировку ячеек, которые являются CD31 + CD45- в установленной коллекторной трубке. Храните сборные трубки на льду для дальнейшего анализа.
Образцы могут быть обработаны для приложений секвенирования следующего поколения. В исследовании изменение времени пищеварения повлияло на выход клеток и процент жизнеспособности. Время пищеварения 20 минут привело к оптимальному выходу с низким процентом нежизнеспособных эндотелиальных клеток.
Последующее окрашивание пропидия йодидом показало, что изолированные эндотелиальные клетки оставались жизнеспособными в течение 60 минут после выделения. Чистота клеточной популяции оценивалась с помощью количественного анализа ПЦР или qPCRR экспрессии генов эндотелиальных клеток, показывающего сильное обогащение генов эндотелиальных клеток в популяции CD31 + CD45. Очистка РНК из изолированных эндотелиальных клеток, преобразующих и усиливающих кДНК посредством подготовки библиотеки и секвенирования Библиотека кДНК привела к более чем 16 000 генов, идентифицированных в девяти независимых образцах.
Падение транскриптов на миллион считываний или TPM наблюдалось в генах ниже этого порога. Секвенирование одноклеточной РНК изолированных эндотелиальных клеток сетчатки через 10-кратный конвейер геномики привело к медиане 1 171 гена на клетку, 15 247 обнаруженных генов и медиане 2 255 уникальных молекулярных идентификаторов или UMI на клетку в 917 клетках. Критическими шагами в этом протоколе являются изоляция ткани сетчатки и переваривание тканей, которые должны выполняться точно, как описано, для оптимизации выхода и жизнеспособности клеток.
Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы в передовых методах секвенирования, таких как секвенирование РНК цельного транскриптома, секвенирование одноклеточной РНК, секвенирование иммунопреципитации хроматина и анализ для транспозазного секвенирования хроматина. Использование этого оптимизированного метода в сочетании с методами секвенирования следующего поколения и вычислительными подходами может дополнительно прояснить механизмы взаимосвязанных сигнальных путей, которые регулируют развитие сосудов.
