脱細胞化肺スライスから調製された人工肺組織

このプロトコルは、三次元組織培養基質および適度なスループットとしての無傷の肺細胞外マトリックスの反復可能な使用を可能にする。操作された肺組織システムの主な利点は、プラットフォームの柔軟性です。ELTは、関心のある様々な組織足場、細胞、または培養培地を使用するように適合させることができる。

肺が抽出されたら、10ミリリットルのシリンジにフェノールレッドを含まないアガロースとHBSSを充填します。気管カニューレを介して約10ミリリットルの空気で肺を膨らませ、肺葉の最も遠位先端が膨張するまで、直ちに気管カニューレを介して調製されたアガロースを注入する。4方向活栓から気管カニューレの女性のルアーロックに白いキャップを取り付けて気管をキャップします。

肺を氷の上の150ミリメートルのペトリ皿に入れて、アガロースが固まるようにします。原稿のプロトコルに従って肺スライスを準備し、100ミリメートルのペトリ皿に1/3容量のPBSを充填する。カセットとタブを鉗子を使用して皿に移す。

スライスが凍結している場合は、室温のPBSに注いで一度に1皿ずつ解凍します。次に、解凍したスライスを150ミリメートルのペトリ皿に移す。細かい鉗子または止血剤を使用してスライスを静かに広げ、組織の周囲から余分なPBSを慎重に吸引します。

次に、カミソリの刃の全長を皿にしっかりと押し付け、それを左右にわずかに揺らすことによって、スライスから幅3ミリメートル、少なくとも9ミリメートルの長さのストリップを切り取ります。ティッシュストリップをカセットにクリップで留めるには、カセットの上に浮かべ、両端のクリップの穴を越えて伸びるように慎重に中央に配置します。タブを細い鉗子で片方の端の穴に部分的に入れ、組織を静かにまっすぐにして、2番目のタブをセットします。

最後に、鉗子を使用して各タブを完全に押し込み、組織を固定します。すべての側面をクリッピングした後、カセットを入れた100ミリメートルの皿を層流フードに移します。第1の脱細胞化溶液を含む6ウェルプレートにカセットを移し、湾曲した止血剤を用いて、切り欠きのある側面を把持した。

次いで、6ウェルプレートを30RPMのオービタルシェーカー上に10分間置く。各ウェルから流体を吸引し、次いでそれをウェル当たり3ミリリットルの第2の脱細胞化溶液と交換する。プレートを30RPMのオービタルシェーカーの上に置き、5分間インキュベートする。

原稿の脱細胞化プロトコルに概説されているように、各溶液でこのプロセスを繰り返します。PBSで最終すすぎを行った後、組織を抗生物質および抗真菌剤を含む新鮮なPBSを含む滅菌6ウェルプレートに移し、摂氏37度で48時間インキュベートする。抗生物質および抗真菌剤で滅菌した後、肺組織足場を直ちに播種するか、摂氏4度で最大30日間保存することができる。

培養に利用する前に、摂氏4度で保存した足場を、新鮮なPBSおよび抗生物質および抗真菌薬と共に、追加の滅菌ステップとして摂氏37度で一晩インキュベートする。次いで、足場を滅菌PBSですすぎ、1ウェルあたり5ミリリットル、3回、それぞれ5分間すすいだ。位相差顕微鏡下で足場を倍率5倍で調べ、播種する組織を選択する。

内皮細胞懸濁液を内皮培地中に500万細胞/ミリリットルで調製し、スライスあたり500,000個の内皮細胞を播種するのに十分な細胞を有する。オートクレーブ処理された播種浴を100ミリメートルのペトリ皿に入れ、すすぎ足場を逆さまに慎重に播種浴に移します。調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させて混合する。

次いで、ウェルの基部にある各組織の上に100マイクロリットルの細胞を直接慎重にピペットし、ピペットチップで組織を損傷しないように注意する。播種した組織を細胞培養インキュベーターに移す。内皮細胞播種から24時間後、手動ピペットを用いて予め加温した培養培地900マイクロリットルを各ウェルに加え、次いでプレートをインキュベーターに戻した。

細胞播種24時間後、培地を除去し、1ウェルあたり1ミリリットルの新鮮な内皮培地を交換する。内皮細胞を播種してから72時間後に、AEC2s、又は肺胞上皮II型細胞、及び線維芽細胞を血球計数器を用いて計数し、AEC2増殖培地中の1:1細胞懸濁液を1ミリリットル当たり500万細胞で調製した。各播種浴から培地をよくピペットでピペットし、調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させた。

ウェルの基部にある各組織の上に100マイクロリットルの細胞を直接ピペットする。播種した組織を細胞培養インキュベーターに移す。2時間後、予め加温したAEC2増殖培地900マイクロリットルを各ウェルに加え、次いでプレートをインキュベーターに戻した。

AEC2sおよび線維芽細胞を用いて24時間培養した後、1ウェルあたり、カセットあたり1ミリリットルの予め加温されたAEC2増殖培地を含む12ウェルプレートを作製する。播種浴の各ウェルから800マイクロリットルの培地をピペットし、次いで、播種浴からカセットを取り出し、それらを右側から調製した12ウェルプレートまで移し、1ウェルにつき1つのカセットを移す。ガラス製パスツールピペットを使用して、所望の培養期間の間、1日おきに培地を慎重に交換する。

培養期間を通して5倍の倍率で位相差顕微鏡を介して組織再集団化の程度をモニターする。組織足場のHおよびE染色は、目に見える細胞核を有さずに脱細胞化後に保存された肺胞構造を示した。脱細胞化した細胞外マトリックス足場材を位相差顕微鏡により倍率5倍で観察したときに肺胞組織を観察した。

大きな枝分かれした気道と血管もいくつかのスライスで見えました。培養7日目に、位相差顕微鏡は、操作された肺組織における再細胞化のパターンが、再集団化が成功した場合の組織肺胞構造をエミュレートすることを示した。貧弱な再細胞化も目に見えた。

7日目または8日目のHおよびE染色は、肺胞中隔の再定常性を示した。免疫蛍光静置により、プロコラーゲンI型α1陽性線維芽細胞、ABCA3陽性AEC2s、CD31陽性内皮細胞、SPB陽性AEC2sが豊富に存在することが明らかになった。さらに、チミジンアッセイは、多くの増殖AEC2を示した。

この技術は、肺組織工学のための戦略の開発を容易にし、肺胞内のII型細胞の増殖および分化を支持するキューの調査を可能にした。