Este protocolo permite el uso repetible de la matriz extracelular pulmonar intacta como sustrato de cultivo de tejido tridimensional y rendimiento moderado. La principal ventaja del sistema de tejido pulmonar diseñado es la flexibilidad de la plataforma. Los ELT se pueden adaptar para utilizar varios andamios tisulares, células o medios de cultivo de interés.
Una vez extraídos los pulmones, llene una jeringa de 10 mililitros con agarosa y HBSS sin rojo fenol. Infle los pulmones con aproximadamente 10 mililitros de aire a través de la cánula de la tráquea, luego inyecte inmediatamente la agarosa preparada a través de la cánula de la tráquea hasta que se inflen las puntas más distales de los lóbulos pulmonares. Cubra la tráquea uniendo la tapa blanca de una llave de paso de cuatro vías a la cerradura luer hembra de la cánula traqueal.
Coloque el pulmón en una placa de Petri de 150 milímetros sobre hielo para permitir que la agarosa se solidifique. Prepare las rodajas de pulmón de acuerdo con el protocolo en el manuscrito y luego llene una placa de Petri de 100 milímetros con 1/3 de volumen de PBS. Transfiera casetes y pestañas al plato usando fórceps.
Si las rebanadas están congeladas, descongele un plato a la vez vertiendo PBS a temperatura ambiente. Luego, transfiera una rebanada descongelada a una placa de Petri de 150 milímetros. Despliegue suavemente la rebanada con fórceps finos o un hemostático y aspire cuidadosamente el exceso de PBS alrededor del tejido.
Luego, corte una tira de tres milímetros de ancho y al menos nueve milímetros de largo de la rebanada presionando toda la longitud de una cuchilla de afeitar firmemente contra el plato y balanceándola ligeramente de lado a lado. Para sujetar la tira de tejido en el cassette, flote sobre el cassette, centrándolo cuidadosamente para extenderse más allá de los orificios en los clips en cada extremo. Coloque una pestaña parcialmente en el orificio en un extremo con fórceps finas, enderece suavemente el tejido y coloque la segunda pestaña.
Finalmente, use fórceps para presionar cada pestaña completamente para asegurar el tejido. Después de recortar todos los lados, transfiera el plato de 100 milímetros que contiene los casetes a una campana de flujo laminar. Transfiera casetes a placas de seis pocillos que contengan la primera solución de descelularización utilizando un hemostático curvo para agarrar los lados con muescas.
Luego, coloque la placa de seis pocillos en un agitador orbital a 30 RPM durante 10 minutos. Aspire el líquido de cada pozo, luego reemplácelo con tres mililitros de la segunda solución de descelularización por pozo. Coloque la placa en un agitador orbital a 30 RPM e incube durante cinco minutos.
Repita este proceso con cada solución como se describe en el protocolo de descelularización en el manuscrito. Después del enjuague final con PBS, transfiera los tejidos a placas estériles de seis pocillos que contengan PBS fresco con antibióticos y antimicóticos e incube a 37 grados Celsius durante 48 horas. Después de la esterilización con antibióticos y antimicóticos, los andamios de tejido pulmonar se pueden sembrar inmediatamente o almacenarse a cuatro grados centígrados durante un máximo de 30 días.
Antes de utilizarlos para el cultivo, incube andamios almacenados a cuatro grados Celsius con PBS fresco y antibióticos y antimicóticos durante la noche a 37 grados Celsius como un paso adicional de esterilización. Luego, enjuague los andamios con PBS estéril, cinco mililitros por pozo, tres veces, durante cinco minutos cada uno. Examine los andamios bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 5X para seleccionar los tejidos para la siembra.
Prepare la suspensión de células endoteliales en medio endotelial a 5 millones de células por mililitro con células suficientes para sembrar 500, 000 células endoteliales por rebanada. Coloque los baños de siembra en autoclave en placas de Petri de 100 milímetros y transfiera cuidadosamente los andamios de enjuague boca abajo a los baños de siembra. Agite suavemente la suspensión celular preparada para mezclar.
Luego, pipetee cuidadosamente 100 microlitros de células directamente sobre cada tejido en la base de los pozos, teniendo cuidado de no dañar el tejido con la punta de la pipeta. Transfiera los tejidos sembrados a la incubadora de cultivo celular. 24 horas después de la siembra de células endoteliales, agregue 900 microlitros de medio de cultivo precalentado a cada pozo usando una pipeta manual, luego devuelva la placa a la incubadora.
Después de 24 horas de siembra celular, retire el medio y reemplace el mililitro de medio endotelial fresco por pozo. 72 horas después de sembrar las células endoteliales, cuente las AEC2 o células epiteliales alveolares tipo II y los fibroblastos utilizando un hemocitómetro y prepare una suspensión celular 1: 1 en medio de crecimiento AEC2 a 5 millones de células por mililitro. Pipetee bien el medio de cada baño de siembra y gire suavemente la suspensión celular preparada.
Pipete 100 microlitros de células directamente sobre cada tejido en la base del pozo. Transfiera los tejidos sembrados a la incubadora de cultivo celular. Después de dos horas, agregue 900 microlitros de medio de crecimiento AEC2 precalentado a cada pozo, luego devuelva la placa a la incubadora.
Después de 24 horas de cultivo con AEC2 y fibroblastos, prepare una placa de 12 pocillos con un mililitro de medio de crecimiento AEC2 precalentado por pozo, por casete. Pipete 800 microlitros de medio de cada pozo del baño de siembra, luego retire los casetes del baño de siembra y transfiéralos del lado derecho hasta la placa de 12 pocillos preparada, un cassette por pozo. Cambie el medio de cultivo con cuidado usando una pipeta Pasteur de vidrio cada dos días durante la duración deseada del cultivo.
Controlar el grado de repoblación tisular mediante microscopía de contraste de fase con un aumento de 5X durante toda la duración del cultivo. La tinción H y E de andamios tisulares mostró una arquitectura alveolar preservada después de la descelularización sin núcleos celulares visibles. Se observó tejido alveolar cuando se observaron andamios de matriz extracelularizada a un aumento de 5X mediante microscopía de contraste de fase.
Las vías respiratorias y los vasos ramificados grandes también eran visibles en algunas rebanadas. En el séptimo día de cultivo, la microscopía de contraste de fase mostró que el patrón de recelularización en los tejidos pulmonares modificados emulaba la estructura alveolar de los tejidos en casos de repoblación exitosa. También se observó una recelularización deficiente.
La tinción H y E en el día siete u ocho mostró repoblación de los septos alveolares. La inmunofluorescencia de pie reveló fibroblastos pro-colágeno tipo I alfa 1 positivos, AEC2s ABCA3 positivos, células endoteliales CD31-positivas, y abundantes AEC2 SPB-positivos. Además, el ensayo de timidina mostró muchas AEC2 proliferantes.
Esta técnica ha facilitado el desarrollo de estrategias para la ingeniería del tejido pulmonar y ha permitido investigar las colas que apoyan la proliferación y diferenciación de células de tipo II dentro del alvéolo.
