Nous avons développé une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture. Cette méthode peut fournir des facteurs exogènes au milieu de culture et peut tester la réactivation des neuroblastes. De meilleures thérapies à base de cellules souches pourraient être développées en comprenant mieux comment les cellules souches quiescentes réagissent aux signaux extrinsèques et entrent dans le cycle cellulaire.
Susan Doyle, une chercheuse scientifique de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cueillez soigneusement environ 20 à 25 larves fraîchement écloses dans la plaque de gélose au raisin sous un microscope à dissection. Remplissez une boîte de Petri avec environ deux millilitres de PBS et immergez la pointe de l’outil contenant des larves dans pbS pendant deux minutes.
Après deux minutes, basculez le plat à un angle pour mettre le liquide en commun au fond et, à l’aide d’un petit pinceau, brossez les larves hors du liquide au fond de la boîte de Pétri. Recueillir toutes les larves sur le pinceau et rincer brièvement les larves dans de l’éthanol à 70% avant de les transférer dans la boîte de Petri contenant du PBS. Vaporisez la zone de travail, les outils de dissection, les pinces et deux plats de montre en verre avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher sur le banc.
Faites le milieu de culture de Schneider complété, ou SSM, et placez-le sur la glace. Pipette un millilitre du support dans chaque plat de montre en verre. À l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile, transférez les larves fraîchement écloses de la plaque de PBS au SSM dans le premier plat de montre en verre.
Disséquez les cerveaux des larves placées dans le deuxième plat de montre en verre avec SSM à l’aide de pinces sous un microscope à dissection et en ajustant le grossissement au besoin. Utilisez une pince pour saisir les crochets buccaux et, avec l’autre, attrapez doucement le corps à mi-chemin et tirez dans la direction opposée pour diviser la larve en deux morceaux. Après avoir disséqué 15 à 20 cerveaux, ajoutez un millilitre de MSS dans un puits d’un plateau de culture stérile de 24 puits.
À l’aide d’une micropipette et d’une pointe stérile, transférez les cerveaux fraîchement disséqués dans le MSU, puis incubation du milieu avec des cerveaux pendant 24 heures à 25 degrés Celsius. Pipette 10 microlitres d’un stock de 10 millimolaires de 5-éthyynyl-2'désoxyuridine, ou EDU, avec 990 microlitres de MSU dans un tube de microcentrifugeuse stérile, mélanger, puis pipeter un millilitre de SSM EDU dans un puits du plateau de culture stérile à 12 puits. Transférer les cerveaux à l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile du puits contenant du MSU au nouveau puits contenant la solution EDU SSM et incuber pendant une heure à 25 degrés Celsius.
Ensuite, transférez les cerveaux marqués EDU dans un autre puits dans le même plateau de culture contenant un millilitre de fixateur et laissez les cerveaux être fixés pendant 20 minutes. Après la fixation, transférez rapidement les cerveaux dans un puits de minitray de 72 puits à l’aide d’une micropipette. Rincez le cerveau trois fois dans 10 microlitres de PBT et répétez trois lavages pendant 10 minutes chacun, en vous assurant que les cerveaux sont toujours recouverts de liquide.
Pipette 10 microlitres de solution bloquante sur le cerveau. Couvrez le plateau et scellez-le avec une bande de parafilm autour du bord. La figure montre des cellules neuroblastiques EDU positives et positives de grande taille après 24 heures de culture dans le MSU avec insuline et coloration.
Après 24 heures dans le milieu de Schneider sans insuline, les cerveaux de type sauvage Oregon R fraîchement éclos n’avaient pas de cellules neuroblastiques EDU positives et mortes positives de grande taille, à l’exception des cellules neuroblastiques à quatre corps de champignons et d’une cellule neuroblastique ventrolatérale. Au cours de l’imagerie confocale, certains hémisphères cérébraux présentant des dommages, tels que des trous de petite à grande taille dans le tissu cérébral explanté, ont parfois été observés. Les cerveaux présentant des trous n’ont pas été utilisés pour l’analyse.
Disséquez soigneusement les tissus et pipetez doucement pour éviter tout dommage aux tissus. Essayez également d’être aussi stérile que possible et de ne pas contaminer vos cultures. Parce que le milieu de culture peut être facilement manipulé en ajoutant différents facteurs, cette technique peut être utilisée pour répondre aux hypothèses futures concernant la signalisation extrinsèque et l’entrée et la sortie de la quiescence des neuroblastes.
