Wir haben eine Methode entwickelt, um ruhende neurale Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten zu reaktivieren. Diese Methode kann exogene Faktoren an die Kulturmedien liefern und die Reaktivierung von Neuroblasten untersuchen. Bessere Stammzelltherapien könnten durch ein besseres Verständnis entwickelt werden, wie ruhende Stammzellen auf extrinsische Hinweise reagieren und in den Zellzyklus eintreten.
Das Verfahren wird Susan Doyle, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren. Um zu beginnen, pflücken Sie vorsichtig etwa 20 bis 25 frisch geschlüpfte Larven aus der Traubenagarplatte unter einem Seziermikroskop. Füllen Sie eine Petrischale mit etwa zwei Millilitern PBS und tauchen Sie die Spitze des Werkzeugs mit Larven für zwei Minuten in PBS.
Nach zwei Minuten kippen Sie die Schale in einem Winkel, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln, und bürsten Sie die Larven mit einem kleinen Pinsel aus der Flüssigkeit auf den Boden der Petrischale. Sammeln Sie alle Larven auf dem Pinsel und spülen Sie die Larven kurz in 70% Ethanol ab, bevor Sie sie zurück in die Petrischale mit PBS geben. Besprühen Sie den Arbeitsbereich, die Sezierwerkzeuge, die Pinzette und zwei Glasuhrenschalen mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf der Bank trocknen.
Machen Sie das ergänzte Schneider'sche Kulturmedium, kurz SSM, und legen Sie es auf Eis. Pippen Sie einen Milliliter des Mediums in jede Glasuhrenschüssel. Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der PBS-Platte in die SSM in der ersten Glasuhrenschüssel.
Sezieren Sie die Gehirne aus den Larven, die in der zweiten Glasuhrenschale mit SSM platziert sind, mit einer Pinzette unter einem Seziermikroskop und passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf an. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mundhaken zu greifen, und greifen Sie mit der anderen vorsichtig den Körper auf halber Höhe nach unten und ziehen Sie in die entgegengesetzte Richtung, um die Larve in zwei Stücke zu teilen. Nachdem Sie 15 bis 20 Gehirne seziert haben, fügen Sie einen Milliliter SSM in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturschale hinzu.
Mit einer Mikropipette und einer sterilen Spitze die frisch sezierten Gehirne in den SSM überführen, gefolgt von der Inkubation der Medien mit Gehirnen für 24 Stunden bei 25 Grad Celsius. Pipettieren Sie 10 Mikroliter eines 10-Millimolaren Vorrats von 5-Ethynyl-2'desoxyuridin oder EDU mit 990 Mikrolitern SSM in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, mischen Sie, pipettieren Sie dann einen Milliliter EDU SSM in eine Vertiefung der sterilen 12-Well-Kulturschale. Übertragen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der Welle, die SSM enthält, in die neue Welle, die die EDU SSM-Lösung enthält, und inkubieren Sie für eine Stunde bei 25 Grad Celsius.
Als nächstes übertragen Sie die EDU-markierten Gehirne in eine andere Vertiefung in derselben Kulturschale, die einen Milliliter Fixiermittel enthält, und lassen Sie die Gehirne für 20 Minuten fixieren. Übertragen Sie das Gehirn nach der Fixierung schnell mit einer Mikropipette in eine Minitray-Vertiefung mit 72 Wells. Spülen Sie das Gehirn dreimal in 10 Mikrolitern PBT und wiederholen Sie drei Wäschen für jeweils 10 Minuten, um sicherzustellen, dass das Gehirn immer mit etwas Flüssigkeit bedeckt ist.
Pipette 10 Mikroliter blockierende Lösung auf das Gehirn. Decken Sie das Tablett ab und verschließen Sie es mit einem Streifen Parafilm um den Rand. Die Abbildung zeigt großformatige EDU-positive und tote pan-positive Neuroblastenzellen nach 24 Stunden Kultivierung in SSM mit Insulin und Färbung.
Nach 24 Stunden in ergänzten Schneider-Medien ohne Insulin hatten die frisch geschlüpften Oregon R-Wildtyp-Gehirne keine großformatigen EDU-positiven und toten-positiven Neuroblastenzellen, außer den Vier-Pilzkörper-Neuroblastenzellen und einer ventrolateralen Neuroblastenzelle. Während der konfokalen Bildgebung wurden gelegentlich einige Gehirnhälften mit Schäden, wie kleine bis große Löcher im explantierten Hirngewebe, beobachtet. Alle Gehirne mit Löchern wurden nicht für die Analyse verwendet.
Sezieren Sie das Gewebe vorsichtig und pipettieren Sie es vorsichtig, um Gewebeschäden zu vermeiden. Versuchen Sie auch, so steril wie möglich zu sein und Ihre Kulturen nicht zu kontaminieren. Da die Kulturmedien leicht manipuliert werden können, indem verschiedene Faktoren hinzugefügt werden, kann diese Technik verwendet werden, um zukünftige Hypothesen bezüglich extrinsischer Signalgebung und Neuroblastenstillstandseintritt und -austritt aufzustellen.
