هذا البروتوكول مهم لأنه يعزل السلالات الفطرية ذات الإمكانات العالية للتحلل مباشرة من عينات التربة ليتم اعتبارها مرشحة لأغراض المعالجة البيولوجية. هذا البروتوكول هو فحص منخفض التكلفة للعثور على الفطريات ذات إمكانات المعالجة الحيوية. علاوة على ذلك ، فإنه يعطي نتائج سهلة التفسير.
نظرا لأن هذه التقنية تنطوي على التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة ، فمن المهم جدا العمل في العقم باستخدام خزانة تدفق صفحية أو موقد بنسن لتجنب التلوث. للبدء ، قم بأخذ عينات من التربة ذات الأهمية وغربلة التربة باستخدام شبكة بمليمترين لإزالة أي جذور وحطام نباتي. تحت خزانة تدفق صفحية ، أضف جراما واحدا من التربة المنخلة إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر.
ثم ، أضف 10 ملليلتر من الماء المعقم منزوع الأيونات لجعل 10 إلى تخفيف ناقص واحد. رج الأنبوب أفقيا لمدة 30 دقيقة. قبل أن يستقر التعليق ، خذ ملليلتر واحد من 10 إلى تخفيف ناقص واحد باستخدام ماصة معقمة وانقله إلى تسعة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات فارغا لجعل 10 إلى سالب اثنين من التخفيف.
دوامة التعليق بدقة. وبالمثل ، قم بعمل تخفيف 10 إلى ناقص ثلاثة من 10 إلى أنبوب تخفيف ناقص اثنين. لطلاء تخفيفات التربة على وسائط انتقائية ، قم بجمع 100 ميكرولتر من 10 إلى ثلاثة سالب تخفيف باستخدام ماصة دقيقة مع نقطة معقمة ونقلها إلى طبق أجار بيتري الدبالي.
قم بتوزيع التخفيف بالتساوي على سطح الطبق باستخدام موزع خلايا معقم يمكن التخلص منه على شكل حرف L. إعداد أربعة إلى خمسة من هذه الأطباق. وبالمثل ، قم بإعداد أطباق الليجنوسليلوز من 10 إلى أنبوب تخفيف ناقص ثلاثة.
اترك الأطباق لتجف في الهواء لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل احتضانها عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 يوما. تحقق من جميع المستعمرات الفطرية الموجودة بحثا عن أوجه التشابه. إذا لزم الأمر ، قم بإعداد شريحة ليتم ملاحظتها تحت المجهر الضوئي.
تحت خزانة التدفق الرقائقي أو في موقد بنسن ، اعزل كل سلالة فطرية مختارة عن طريق إزالة جزء صغير من الميسيليوم بلطف من المستعمرة باستخدام إبرة تلقيح معقمة. انقل المستعمرة المعزولة إلى طبق جديد من مستخلص الشعير أو MEA. انقل 20 ملليلتر من Bushnell Haas ، أو BH المتوسطة ، إلى قوارير زجاجية سعة 50 ملليلتر.
انقل سبعة ملليلترات من الماء منزوع الأيونات إلى قوارير سعة 15 ملليلتر وأضف قطعا من الغطاء الزجاجي المكسور إلى كل قارورة. تعقيم القوارير عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لاختبار النمو على الفازلين ، أضف ملليلتر واحد من الفازلين إلى كل قارورة BH سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة معقمة أسفل خزانة التدفق الرقائقي.
احتفظ ببعض القوارير مع BH فقط كعنصر تحكم سلبي. قم بإزالة الميسيليوم على سطح الوسط من صفيحة MEA باستخدام السلالة الفطرية المختارة باستخدام إبرة معقمة ونقلها إلى قارورة زجاجية سعة 15 ملليلتر مع انزلاقات الغطاء المكسورة. حرك القارورة على خلاط دوامة لمدة دقيقتين ، مما يسمح للغطاء المكسور بقطع مكعب المستعمرة الفطرية ، مما يجعل التعليق.
قم بتلقيح كل قارورة بترولاتوم بتعليق 200 ميكرولتر. جعل اثنين من النسخ المتماثلة لكل سلالة فطرية. للتحكم السلبي ، أضف 200 ميكرولتر من التعليق الفطري إلى القارورة التي تحتوي على وسط BH فقط.
أيضا ، احتفظ بالقارورة مع الفازلين دون أي تلقيح فطري للتحقق من وجود تلوث في الوسط. احتضن القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام وراقبها بعد 15 و 30 يوما من اللقاح. لاختبار النمو على زيت المحرك المستعمل، انقل 500 ميكرولتر من زيت المحرك المستخدم إلى طبق BHA Petri وقم بتوزيع الزيت بالتساوي.
ثم ، قم بتلقيح الصفيحة بسلالة فطرية عن طريق جمع الميسيليوم من ألواح MEA. لاختبار النمو على البلاستيك ، انقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري إلى صفيحة 96 ميكروويل. اصنع ثلاثة نسخ طبق الأصل من مزيج السلالة الفطرية والبلاستيك.
أضف 10 ملليغرام من مسحوق بلاستيكي مختلف إلى كل بئر مع التعليق الفطري. للتحكم السلبي ، أضف 200 ميكرولتر من وسط BH إلى البئر مع التعليق الفطري. علاوة على ذلك ، لكل مسحوق بلاستيكي ، املأ بئرا ب 200 ميكرولتر من محلول BH و 10 ملليغرام من كل غبار بلاستيكي للتحقق من التلوث.
احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية في الظلام وراقبها بعد 15 و 30 يوما. لإجراء اختبار كالوريمتري نوعي ، قم بإعداد لتر واحد من أجار سكر العنب البطاطس ، أو PDA ، والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة. بعد التعقيم ، عندما يبرد الوسط ولكنه لا يزال سائلا ، أضف 400 ميكرولتر من guaiacol تحت غطاء تدفق صفائحي وقم بوضعه في أطباق Petri.
قم بتلقيح صفيحة غواياكول PDA بسلالة فطرية عن طريق جمع الميسيليوم من صفيحة MEA. للحصول على ضوابط سلبية ، قم بإعداد لوحات PDA مع كل سلالة فطرية ولوحة واحدة مع PDA و guaiacol. احتضان الألواح عند 25 درجة مئوية في الظلام ومراقبتها بعد سبعة أيام.
لاختبار الاسترازات النوعية ، قم بإعداد لتر واحد من Tween 80 المتوسط. ثم ، ضع الوسط على مقلي مغناطيسي دون تسخين بشريط تحريك داخل الوسط. بعد 10 دقائق ، عندما يذوب كل شيء ، انقل خمسة ملليلتر من الوسط إلى قوارير معقمة سعة 20 ملليلتر وأوتوكلاف.
أضف 200 ميكرولتر من التعليق الفطري إلى قارورة Tween 80 متوسطة التعقيم. للتحكم السلبي ، أضف خمسة ملليلترات من وسط BH المعقم إلى قارورة 20 ملليلتر. ثم ، أضف 200 ميكرولتر من التعليق الفطري إلى القارورة.
احتضان القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 21 يوما ومراقبتها كل سبعة أيام. تم تقييم النسبة المئوية للسلالات الفطرية القادرة على النمو على الفازلين وزيت المحرك المستخدم والمساحيق البلاستيكية كمصدر وحيد للكربون بدرجات مختلفة من النجاح. تم تقييم قدرة الفطريات على استغلال الفازلين على أنها الفرق في نمو المستعمرة بين BH الخاضع للرقابة والمحتوي على الفازلين.
ما يقرب من 75٪ من السلالات التي تم اختبارها كانت قادرة على استخدام الفازلين كمصدر وحيد للكربون وأظهرت 21٪ أقصى قدر من النمو. كما تم رصد نمو الألواح التي تحتوي على BHA فقط وفي وجود زيت المحرك. نمت ما يقرب من 90٪ من السلالات على زيت المحرك المستخدم ، مع 39٪ أظهرت أقصى قدر من النمو.
يشير تكوين هالة حمراء بنية حول المستعمرة الفطرية إلى زيادة إنتاج اللاكات والإنزيمات الأخرى المحللة للجينين. ما يقرب من 60 ٪ من الفطريات كانت قادرة على إنتاج laccases. علاوة على ذلك ، أنتجت 17٪ من السلالات هالة داكنة مكثفة حول المستعمرة في وسط guaiacol.
تم تقييم نشاط Esterases من خلال تكوين راسب أبيض في وسط Tween 80. أظهر ما يقرب من 60٪ من السلالات نشاط الإستراز وأظهر 13٪ تكوين راسب أعلى. يمكن تصميم هذا البروتوكول لفحص الفطريات القادرة على تحلل أي ملوث عن طريق إضافة المادة المتمردة ذات الأهمية إلى الحد الأدنى من وسط الثقافة.
