Этот протокол имеет важное значение, поскольку он изолирует грибковые штаммы с высоким деградирующим потенциалом непосредственно из образцов почвы, которые можно рассматривать в качестве кандидатов для целей биоремедиации. Этот протокол представляет собой недорогой скрининг для поиска грибов с потенциалом биоремедиации. Более того, он дает результаты, которые легко интерпретировать.
Поскольку этот метод включает в себя обработку микроорганизмов, очень важно работать в стерильности с использованием ламинарного проточного шкафа или горелки Бунзена, чтобы избежать загрязнения. Для начала проведите отбор проб интересующей почвы и просейте почву, используя двухмиллиметровую сетку, чтобы удалить любые корни и растительный мусор. Под ламинарный проточный шкаф добавьте один грамм просеянной почвы в стерильную 15-миллилитровую трубку.
Затем добавьте 10 миллилитров стерильной деионизированной воды, чтобы получить 10 до минус одного разведения. Встряхните тюбик горизонтально в течение 30 минут. Прежде чем суспензия осядет, возьмите один миллилитр из 10 до минус одного разведения стерильной пипеткой и переложите его на девятимиллилитр деионизированной заготовки воды, чтобы получить 10 до минус двух разведений.
Тщательно вихрьте подвеску. Аналогично сделайте разбавление от 10 до минус трех от 10 до минус двух разбавленных трубок. Для обшивки почвенных разбавлений на селективных средах собирают 100 микролитров от 10 до минус трех разбавлений с помощью микропипетки со стерильной точкой и перекладывают ее на гуминовый агар Петри.
Равномерно распределите разбавление по поверхности тарелки с помощью стерильного, одноразового, L-образного разбрасывателя клеток. Приготовьте четыре-пять таких блюд. Аналогично готовят блюда из лигноцеллюлозы от 10 до минус трех разведительных пробирок.
Дайте посуде высохнуть на воздухе в течение 10-15 минут перед инкубацией при температуре 25 градусов Цельсия в темноте в течение 15 дней. Проверьте все присутствующие грибковые колонии на наличие сходства. При необходимости подготовьте слайд для наблюдения под световым микроскопом.
Под ламинарным проточным шкафом или на горелке Бунзена изолируйте каждый выбранный грибковый штамм, осторожно удалив небольшую часть мицелия из колонии стерильной иглой для прививки. Перенесите изолированную колонию в новое блюдо с солодовым экстрактом агара, или MEA. Переведите 20 миллилитров Bushnell Haas, или среды BH, в 50-миллилитровые стеклянные флаконы.
Переложите семь миллилитров деионизированной воды в 15-миллилитровые флаконы и добавьте в каждый флакон кусочки битой стеклянной крышки. Стерилизуйте флаконы автоклавированием при 121 градусе Цельсия в течение 20 минут. Чтобы проверить рост на вазелине, добавьте один миллилитр вазелина в каждый 50-миллилитровый флакон BH с помощью стерильной пипетки под ламинарным проточным шкафом.
Держите несколько флаконов только с BH в качестве отрицательного контроля. Удалите мицелий на поверхности среды с пластины MEA с выбранным грибковым штаммом с помощью стерильной иглы и перенесите его в 15-миллилитровый стеклянный флакон с разбитыми крышками. Перемешайте флакон на вихревом смесителе в течение двух минут, позволив сломанной крышке соскользнуть, чтобы разрезать куб грибковой колонии, сделав суспензию.
Инокулируйте каждый флакон вазелина 200 микролитрами суспензии. Сделайте две реплики для каждого грибкового штамма. Для отрицательного контроля добавьте 200 микролитров грибковой суспензии во флакон, содержащий только BH-среду.
Кроме того, держите флакон с вазелином без какой-либо грибковой прививки, чтобы проверить загрязнение в среде. Инкубируйте флаконы при температуре 25 градусов Цельсия в темноте и наблюдайте за ними через 15 и 30 дней из инокулята. Чтобы проверить рост на отработанном моторном масле, переложите 500 микролитров отработанного моторного масла на чашку BHA Petri и равномерно распределите масло.
Затем привите пластину грибковым штаммом, собрав мицелий из пластин MEA. Чтобы проверить рост на пластмассах, переложите 200 микролитров грибковой суспензии в 96-микролуночную пластину. Сделайте три реплики грибкового штамма-пластической комбинации.
Добавьте 10 миллиграммов разного пластикового порошка в каждую лунку с грибковой суспензией. Для отрицательного контроля добавьте 200 микролитров среды BH в колодец с грибковой суспензией. Кроме того, для каждого пластикового порошка заполните колодец 200 микролитрами раствора BH и 10 миллиграммами каждой пластиковой пыли, чтобы проверить наличие загрязнений.
Высиживайте пластины при 25 градусах Цельсия в темноте и наблюдайте за ними через 15 и 30 дней. Для качественного лакказа калориметрического теста приготовьте один литр картофельного декстрозы агара, или КПК, и автоклав в течение 20 минут. После автоклавирования, когда среда остынет, но все еще будет жидкой, добавьте 400 микролитров гуаякола под ламинарную вытяжку и разложите ее в чашку Петри.
Инокулируйте пластину PDA guaiacol грибковым штаммом, собирая мицелий из пластины MEA. Для отрицательного контроля подготовьте пластины КПК с каждым грибковым штаммом и одну пластину с КПК и гуайаколом. Высиживайте пластины при температуре 25 градусов Цельсия в темноте и наблюдайте за ними через семь дней.
Для качественного теста на эстеразы подготовьте один литр среды Tween 80. Затем поместите среду на магнитную мешалку без нагрева с перемешивающим стержнем внутри среды. Через 10 минут, когда все расплавится, переложите пять миллилитров среды в 20-миллилитровые стерильные флаконы и автоклав.
Добавьте 200 микролитров грибковой суспензии в средний стерилизованный флакон Tween 80. Для отрицательного контроля добавьте пять миллилитров автоклавной среды BH во флакон с 20 миллилитрами. Затем добавьте во флакон 200 микролитров грибковой суспензии.
Высиживайте флаконы при температуре 25 градусов Цельсия в темноте в течение 21 дня и соблюдайте их каждые семь дней. Был оценен процент грибковых штаммов, способных расти на вазелине, отработанном моторном масле и пластиковых порошках в качестве единственного источника углерода с разной степенью успеха. Способность грибов эксплуатировать вазелин оценивалась как разница в росте колонии между контролируемым BH и содержащим вазелином.
Почти 75% протестированных штаммов смогли использовать вазелин в качестве единственного источника углерода, а 21% продемонстрировали максимальный рост. Также отслеживался рост пластин, содержащих только BHA и в присутствии моторного масла. Почти 90% штаммов выросли на отработанном моторном масле, причем 39% показали максимальный рост.
Образование красно-коричневатого ореола вокруг грибковой колонии указывало на более высокую выработку лакказов и других лигнинолитических ферментов. Примерно 60% грибов смогли произвести лаккезы. Более того, 17% штаммов произвели интенсивный темный ореол вокруг колонии в среде гуаякола.
Активность эстераз оценивали по образованию белого осадка в среде Tween 80. Почти 60% штаммов показали активность эстераз, а 13% продемонстрировали более высокое образование осадков. Этот протокол может быть адаптирован для скрининга грибов, способных разлагать любой загрязнитель, путем добавления непокорного вещества, представляющего интерес, в минимальную культуральную среду.
