Este protocolo es significativo porque aísla cepas fúngicas con alto potencial degradativo directamente de muestras de suelo para ser consideradas como candidatas con fines de biorremediación. Este protocolo es un cribado de bajo coste para encontrar hongos con potencial de biorremediación. Además, da resultados que son fáciles de interpretar.
Dado que esta técnica implica el manejo de microorganismos, es muy importante trabajar en esterilidad utilizando un gabinete de flujo laminar o un quemador Bunsen para evitar la contaminación. Para comenzar, muestree el suelo de interés y tamice el suelo con una malla de dos milímetros para eliminar las raíces y los restos de plantas. Debajo de un gabinete de flujo laminar, agregue un gramo del suelo tamizado en un tubo estéril de 15 mililitros.
Luego, agregue 10 mililitros de agua desionizada estéril para hacer una dilución de 10 a menos uno. Agite el tubo horizontalmente durante 30 minutos. Antes de que la suspensión se asiente, tome un mililitro de 10 a la dilución menos uno con una pipeta estéril y transfiéralo a un espacio en blanco de nueve mililitros de agua desionizada para hacer una dilución de 10 a menos dos.
Vórtice la suspensión a fondo. Del mismo modo, haga una dilución de 10 a menos tres de un tubo de dilución de 10 a menos dos. Para emplatar las diluciones del suelo en medios selectivos, recolecte 100 microlitros de la dilución de 10 a menos tres usando una micropipeta con un punto estéril y transfiérala a una placa de Petri de agar húmico.
Distribuya la dilución uniformemente en la superficie del plato utilizando un esparcidor celular estéril, desechable y en forma de L. Prepare de cuatro a cinco de estos platos. Del mismo modo, prepare platos de lignocelulosa de un tubo de dilución de 10 a menos tres.
Deje que los platos se sequen al aire durante 10 a 15 minutos antes de incubar a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 15 días. Verifique todas las colonias de hongos presentes para ver si hay similitudes. Si es necesario, prepare una diapositiva para ser observada bajo un microscopio de luz.
Debajo de un gabinete de flujo laminar o en un quemador Bunsen, aísle cada cepa fúngica elegida eliminando suavemente una pequeña parte del micelio de la colonia con una aguja de inoculación estéril. Transfiera la colonia aislada a un nuevo plato de agar de extracto de malta, o MEA. Transfiera 20 mililitros de Bushnell Haas, o medio BH, a viales de vidrio de 50 mililitros.
Transfiera siete mililitros de agua desionizada a viales de 15 mililitros y agregue trozos de cubierta de vidrio roto en cada vial. Esterilizar los viales en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Para probar el crecimiento en vaselina, agregue un mililitro de vaselina a cada vial de BH de 50 mililitros con una pipeta estéril debajo del gabinete de flujo laminar.
Mantenga algunos viales con solo BH como control negativo. Retire el micelio en la superficie del medio de la placa MEA con la cepa fúngica elegida con una aguja estéril y transfiéralo a un vial de vidrio de 15 mililitros con los resbalones de la cubierta rotos. Agite el vial en un mezclador de vórtice durante dos minutos, permitiendo que los resbalones de la cubierta rota corten el cubo de la colonia de hongos, haciendo una suspensión.
Inocular cada vial de vaselina con suspensión de 200 microlitros. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica. Para el control negativo, agregue 200 microlitros de suspensión fúngica en el vial que contenga solo medio BH.
Además, mantenga el vial con vaselina sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio. Incubar los viales a 25 grados centígrados en la oscuridad y observarlos después de 15 y 30 días desde el inóculo. Para probar el crecimiento en aceite de motor usado, transfiera 500 microlitros de aceite de motor usado a la placa de Petri BHA y distribuya el aceite de manera uniforme.
Luego, inocule la placa con cepa fúngica recolectando el micelio de las placas MEA. Para probar el crecimiento en plásticos, transfiera 200 microlitros de suspensión de hongos a una placa de 96 micropocillos. Haga tres réplicas de la combinación de cepa fúngica y plástico.
Agregue 10 miligramos de un polvo de plástico diferente a cada pozo con la suspensión de hongos. Para el control negativo, agregue 200 microlitros de bh medio al pozo con la suspensión de hongos. Además, para cada polvo de plástico, llene un pozo con 200 microlitros de solución BH y 10 miligramos de cada polvo de plástico para verificar si hay contaminación.
Incuba las placas a 25 grados centígrados en la oscuridad y obsérvalas después de 15 y 30 días. Para la prueba calorimétrica cualitativa de lacasas, prepare un litro de agar de dextrosa de papa, o PDA, y autoclave durante 20 minutos. Después del autoclave, cuando el medio se haya enfriado pero todavía esté líquido, agregue 400 microlitros de guaiacol debajo de una campana de flujo laminar y empáquelo en placas de Petri.
Inocular la placa de guaiacol PDA con cepa fúngica recogiendo el micelio de la placa MEA. Para controles negativos, prepare placas de PDA con cada cepa de hongos y una placa con PDA y guaiacol. Incuba las placas a 25 grados centígrados en la oscuridad y obsérvalas después de siete días.
Para la prueba cualitativa de esterasas, prepare un litro de tween 80 medio. Luego, coloque el medio en un agitador magnético sin calentar con una barra de agitación dentro del medio. Después de 10 minutos, cuando todo esté derretido, transfiera cinco mililitros del medio a viales estériles de 20 mililitros y autoclave.
Agregue 200 microlitros de suspensión fúngica al vial esterilizado medio Tween 80. Para el control negativo, agregue cinco mililitros de medio BH en autoclave en un vial de 20 mililitros. Luego, agregue 200 microlitros de suspensión fúngica al vial.
Incubar los viales a 25 grados centígrados en la oscuridad durante 21 días y observarlos cada siete días. Se evaluó el porcentaje de cepas de hongos capaces de crecer en vaselina, aceite de motor usado y polvos plásticos como su única fuente de carbono con diferentes grados de éxito. La capacidad de los hongos para explotar la vaselina se evaluó como la diferencia en el crecimiento de colonias entre el BH controlado y la vaselina que contiene.
Casi el 75% de las cepas probadas pudieron usar vaselina como su única fuente de carbono y el 21% exhibió el máximo crecimiento. También se monitoreó el crecimiento de las placas que contienen solo BHA y en presencia de aceite de motor. Casi el 90% de las cepas crecieron en aceite de motor usado, con un 39% mostrando un crecimiento máximo.
La formación de un halo rojo-marrón alrededor de la colonia de hongos indicó una mayor producción de lacasas y otras enzimas ligninolíticas. Aproximadamente el 60% de los hongos fueron capaces de producir lacasas. Además, el 17% de las cepas produjeron un intenso halo oscuro alrededor de la colonia en el medio guaiacol.
La actividad de las esterasas se evaluó mediante la formación de un precipitado blanco en el medio Tween 80. Casi el 60% de las cepas mostraron actividad de esterasas y el 13% demostraron una mayor formación de precipitados. Este protocolo se puede adaptar para detectar hongos capaces de degradar cualquier contaminante agregando la sustancia recalcitrante de interés a un medio de cultivo mínimo.
