Bu protokol önemlidir, çünkü yüksek bozunma potansiyeline sahip mantar suşlarını, biyoremediasyon amaçları için aday olarak kabul edilecek toprak örneklerinden doğrudan izole eder. Bu protokol, biyoremediasyon potansiyeli olan mantarları bulmak için düşük maliyetli bir taramadır. Dahası, yorumlanması kolay sonuçlar verir.
Bu teknik mikroorganizmaların işlenmesini içerdiğinden, kontaminasyonu önlemek için laminer bir akış kabini veya bir Bunsen brülörü kullanarak sterilitede çalışmak çok önemlidir. Başlamak için, ilgilenilen toprağı örnekleyin ve herhangi bir kök ve bitki kalıntılarını gidermek için iki milimetrelik bir ağ kullanarak toprağı eleyin. Laminer bir akış kabini altında, elenmiş toprağın bir gramını steril 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin.
Daha sonra, eksi bir seyreltmeye 10 mililitre yapmak için 10 mililitre steril deiyonize su ekleyin. Tüpü 30 dakika yatay olarak çalkalayın. Süspansiyon yerleşmeden önce, steril bir pipetle eksi bir seyreltmeye bir mililitre 10 alın ve eksi iki seyreltmeye 10 yapmak için dokuz mililitre deiyonize suya boşaltın.
Süspansiyonu iyice vorteksleyin. Benzer şekilde, eksi üç seyreltme için 10'dan eksi iki seyreltme tüpüne 10'dan eksi iki seyreltme yapın. Toprak seyreltmelerini seçici ortam üzerine kaplamak için, steril bir noktaya sahip bir mikropipet kullanarak eksi üç seyreltmenin 100 mikrolitresini toplayın ve hümik bir agar Petri kabına aktarın.
Steril, tek kullanımlık, L şeklinde bir hücre yayıcı kullanarak seyreltmeyi çanak yüzeyine eşit olarak dağıtın. Bu tür dört ila beş yemek hazırlayın. Benzer şekilde, lignoselüloz tabaklarını 10'dan eksi üç seyreltme tüpüne kadar hazırlayın.
15 gün boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede kuluçkaya yatmadan önce bulaşıkların 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin. Benzerlikler için mevcut tüm mantar kolonilerini kontrol edin. Gerekirse, ışık mikroskobu altında gözlemlenecek bir slayt hazırlayın.
Bir laminer akış kabini altında veya bir Bunsen brülöründe, seçilen her mantar suşunu, miselyumun küçük bir kısmını steril bir aşılama iğnesi ile koloniden nazikçe çıkararak izole edin. İzole edilmiş kolonileri yeni bir malt özü agar veya MEA kabına aktarın. 20 mililitre Bushnell Haas veya BH medium'u 50 mililitrelik cam şişelere aktarın.
Yedi mililitre deiyonize suyu 15 mililitrelik şişelere aktarın ve her şişeye kırık cam kapak kaymaları parçaları ekleyin. Şişeleri 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayarak sterilize edin. Petrolatum üzerindeki büyümeyi test etmek için, laminer akış kabininin altında steril bir pipet kullanarak her 50 mililitrelik BH şişesine bir mililitre petrolatum ekleyin.
Bazı şişeleri negatif kontrol olarak sadece BH ile saklayın. Steril bir iğne kullanarak seçilen mantar suşu ile ortamın yüzeyindeki miselyumu MEA plakasından çıkarın ve kırık kapak kaymalarıyla 15 mililitrelik bir cam şişeye aktarın. Şişeyi bir vorteks karıştırıcı üzerinde iki dakika boyunca çalkalayın, kırık kapak kaymalarının mantar kolonisinin küpünü kesmesine izin vererek bir süspansiyon yapın.
Her petrolatum şişesini 200 mikrolitre süspansiyonla aşılayın. Her mantar suşu için iki kopya yapın. Negatif kontrol için, sadece BH ortamı içeren şişeye 200 mikrolitre mantar süspansiyonu ekleyin.
Ayrıca, ortamdaki kontaminasyonu kontrol etmek için şişeyi herhangi bir mantar aşılaması olmadan petrolatum ile saklayın. Şişeleri karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin ve inokülumdan 15 ve 30 gün sonra gözlemleyin. Kullanılmış motor yağındaki büyümeyi test etmek için, 500 mikrolitre kullanılmış motor yağını BHA Petri kabına aktarın ve yağı eşit şekilde dağıtın.
Daha sonra, miselyumu MEA plakalarından toplayarak plakayı mantar suşu ile aşılayın. Plastikler üzerindeki büyümeyi test etmek için, 200 mikrolitre mantar süspansiyonunu 96 mikrovellik bir plakaya aktarın. Mantar suşu-plastik kombinasyonunun üç kopyasını yapın.
Mantar süspansiyonu ile her bir oyuğa 10 miligram farklı bir plastik toz ekleyin. Negatif kontrol için, mantar süspansiyonu ile kuyuya 200 mikrolitre BH ortamı ekleyin. Ayrıca, her plastik toz için, kontaminasyonu kontrol etmek için bir kuyuyu 200 mikrolitre BH çözeltisi ve her plastik tozun 10 miligramı ile doldurun.
Plakaları karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin ve 15 ve 30 gün sonra gözlemleyin. Kalitatif lakkaz kalorimetrik testi için, bir litre patates dekstroz agar veya PDA hazırlayın ve 20 dakika boyunca otoklav yapın. Otoklavlamadan sonra, ortam soğuduğunda ancak hala sıvı olduğunda, laminer bir akış davlumbazının altına 400 mikrolitre guaiacol ekleyin ve Petri kaplarına yerleştirin.
MEA plakasından miselyum toplayarak PDA guaiacol plakasını mantar suşu ile aşılayın. Negatif kontroller için, her mantar suşu ile PDA plakaları ve PDA ve guaiacol ile bir plaka hazırlayın. Plakaları karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin ve yedi gün sonra gözlemleyin.
Kalitatif esteraz testi için, bir litre Ara 80 orta hazırlayın. Ardından, ortamın içinde bir karıştırma çubuğu ile ortamı ısıtmadan manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. 10 dakika sonra, her şey eritildiğinde, ortamın beş mililitresini 20 mililitrelik steril şişelere ve otoklavlara aktarın.
Tween 80 orta sterilize şişeye 200 mikrolitre mantar süspansiyonu ekleyin. Negatif kontrol için, 20 mililitrelik bir şişeye beş mililitre otoklavlanmış BH ortamı ekleyin. Ardından, şişeye 200 mikrolitre mantar süspansiyonu ekleyin.
Şişeleri 21 gün boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin ve her yedi günde bir gözlemleyin. Petrolatum, kullanılmış motor yağı ve plastik tozları üzerinde tek karbon kaynağı olarak farklı derecelerde başarı ile büyüyebilen mantar suşlarının yüzdesi değerlendirildi. Mantarların petrolatumdan yararlanma yeteneği, kontrollü BH ile petrolatum içeren koloni büyümesindeki fark olarak değerlendirildi.
Test edilen suşların neredeyse% 75'i petrolatumu tek karbon kaynağı olarak kullanabildi ve% 21'i maksimum büyüme sergiledi. Sadece BHA içeren plakaların büyümesi ve motor yağı varlığında da izlendi. Suşların neredeyse% 90'ı kullanılmış motor yağı üzerinde büyüdü,% 39'u maksimum büyüme gösterdi.
Mantar kolonisi etrafında kırmızı-kahverengimsi bir halenin oluşumu, lakkazların ve diğer lininolitik enzimlerin daha yüksek üretimini göstermiştir. Mantarların yaklaşık% 60'ı lakkaz üretebildi. Dahası, suşların% 17'si guaiacol ortamında koloni etrafında yoğun bir karanlık halo üretti.
Esterazların aktivitesi, Tween 80 ortamında beyaz bir çökelti oluşumu ile değerlendirildi. Suşların neredeyse% 60'ı esteraz aktivitesi ve% 13'ü daha yüksek çökelti oluşumu göstermiştir. Bu protokol, ilgilenilen inatçı maddeyi minimal bir kültür ortamına ekleyerek herhangi bir kirleticiyi bozabilen mantarları taramak için uyarlanabilir.
