Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Pilzstämme mit hohem Abbaupotenzial direkt aus Bodenproben isoliert, um als Kandidaten für Bioremediationszwecke in Betracht gezogen zu werden. Dieses Protokoll ist ein kostengünstiges Screening, um Pilze mit Bioremediationspotenzial zu finden. Darüber hinaus liefert es Ergebnisse, die leicht zu interpretieren sind.
Da diese Technik den Umgang mit Mikroorganismen beinhaltet, ist es sehr wichtig, in der Sterilität mit einem Laminar-Flow-Schrank oder einem Bunsenbrenner zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Probieren Sie zunächst den Boden von Interesse ab und sieben Sie den Boden mit einem Zwei-Millimeter-Netz, um Wurzeln und Pflanzenreste zu entfernen. Unter einem Laminar-Flow-Schrank ein Gramm der gesiebten Erde in ein steriles 15-Milliliter-Rohr geben.
Fügen Sie dann 10 Milliliter steriles entionisiertes Wasser hinzu, um eine Verdünnung von 10 bis minus eins zu erhalten. Schütteln Sie das Röhrchen horizontal für 30 Minuten. Bevor sich die Suspension beruhigt, nehmen Sie einen Milliliter von 10 bis minus eins Verdünnung mit einer sterilen Pipette und übertragen Sie ihn auf einen Neun-Milliliter deionisierten Wasserrohling, um 10 bis minus zwei Verdünnung zu machen.
Wirbeln Sie die Aufhängung gründlich aus. In ähnlicher Weise machen Sie eine 10 bis minus drei Verdünnung von einem 10 zum minus zwei Verdünnungsrohr. Um Bodenverdünnungen auf selektiven Medien zu plattieren, sammeln Sie 100 Mikroliter der 10 bis minus drei Verdünnung mit einer Mikropipette mit steriler Stelle und geben Sie sie auf eine Humin-Agar-Petrischale.
Verteilen Sie die Verdünnung gleichmäßig auf der Schalenoberfläche mit einem sterilen, Einweg-L-förmigen Zellstreuer. Bereiten Sie vier bis fünf solcher Gerichte zu. Bereiten Sie in ähnlicher Weise Lignocellulosegerichte aus einem 10- bis zum minus drei-Verdünnungsröhrchen zu.
Lassen Sie das Geschirr 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen, bevor Sie 15 Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Überprüfen Sie alle vorhandenen Pilzkolonien auf Ähnlichkeiten. Bereiten Sie bei Bedarf einen Objektträger vor, der unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden soll.
Isolieren Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank oder an einem Bunsenbrenner jeden ausgewählten Pilzstamm, indem Sie vorsichtig einen kleinen Teil des Myzels mit einer sterilen Impfnadel aus der Kolonie entfernen. Übertragen Sie die isolierte Kolonie in eine neue Malzextrakt-Agar- oder MEA-Schale. Übertragen Sie 20 Milliliter Bushnell Haas oder BH Medium in 50-Milliliter-Glasfläschchen.
Geben Sie sieben Milliliter deionisiertes Wasser in 15-Milliliter-Fläschchen und fügen Sie Stücke von Glasscherben in jede Durchstechflasche ein. Sterilisieren Sie die Fläschchen durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten. Um das Wachstum auf Petrolatum zu testen, fügen Sie jedem 50-Milliliter-BH-Fläschchen mit einer sterilen Pipette unter dem Laminar-Flow-Kabinett einen Milliliter Vaseline hinzu.
Bewahren Sie einige Fläschchen mit nur BH als Negativkontrolle auf. Entfernen Sie das Myzel auf der Oberfläche des Mediums mit dem gewählten Pilzstamm mit einer sterilen Nadel von der MEA-Platte und geben Sie es mit den zerbrochenen Deckblättern in ein 15-Milliliter-Glasfläschchen. Agitieren Sie die Durchstechflasche zwei Minuten lang auf einem Wirbelmischer, so dass die gebrochenen Deckblätter den Würfel der Pilzkolonie schneiden und eine Suspension erzeugen.
Beimpfen Sie jede Petrolatum-Durchstechflasche mit 200 Mikroliter Suspension. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm. Für die Negativkontrolle fügen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension in die Durchstechflasche hinzu, die nur BH-Medium enthält.
Bewahren Sie die Durchstechflasche auch mit Petrolatum ohne Pilzimpfung auf, um nach einer Kontamination im Medium zu suchen. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach 15 und 30 Tagen ab dem Inokulum. Um das Wachstum an gebrauchtem Motoröl zu testen, geben Sie 500 Mikroliter gebrauchtes Motoröl auf die BHA-Petrischale und verteilen Sie das Öl gleichmäßig.
Dann impfen Sie die Platte mit Pilzstamm, indem Sie das Myzel von MEA-Platten sammeln. Um das Wachstum auf Kunststoffen zu testen, übertragen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension in eine 96-Mikrowellenplatte. Machen Sie drei Repliken der Pilzstamm-Kunststoff-Kombination.
Fügen Sie 10 Milligramm eines anderen Kunststoffpulvers zu jeder Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Für die Negativkontrolle fügen Sie 200 Mikroliter BH-Medium in die Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Darüber hinaus füllen Sie für jedes Kunststoffpulver eine Vertiefung mit 200 Mikrolitern BH-Lösung und 10 Milligramm jedes Kunststoffstaubs, um nach Verunreinigungen zu suchen.
Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach 15 und 30 Tagen. Für den qualitativen kalorimetrischen Laccase-Test bereiten Sie einen Liter Kartoffeldextrose-Agar oder PDA vor und autoklavieren Sie für 20 Minuten. Nach dem Autoklavieren, wenn das Medium abgekühlt ist, aber noch flüssig ist, fügen Sie 400 Mikroliter Guaiacol unter eine laminare Haube und schichten Sie es in Petrischalen auf.
Beimpfen Sie die PDA-Guaiacolplatte mit Pilzstamm, indem Sie das Myzel von der MEA-Platte sammeln. Für Negativkontrollen bereiten Sie PDA-Platten mit jedem Pilzstamm und eine Platte mit PDA und Guaiacol vor. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln und beobachten Sie sie nach sieben Tagen.
Für den qualitativen Esterase-Test bereiten Sie einen Liter Tween 80 Medium vor. Legen Sie dann das Medium auf einen Magnetrührer ohne Erwärmung mit einem Rührstab im Inneren des Mediums. Nach 10 Minuten, wenn alles geschmolzen ist, geben Sie fünf Milliliter des Mediums in 20-Milliliter sterile Fläschchen und Autoklaven.
Fügen Sie 200 Mikroliter Pilzsuspension zu der Tween 80 medium sterilisierten Durchstechflasche hinzu. Für die Negativkontrolle fügen Sie fünf Milliliter autoklaviertes BH-Medium in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Pilzsuspension in die Durchstechflasche ein.
Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius im Dunkeln für 21 Tage und beobachten Sie sie alle sieben Tage. Der Prozentsatz der Pilzstämme, die auf Petrolatum, gebrauchtem Motoröl und Kunststoffpulvern als einzige Kohlenstoffquelle mit unterschiedlichem Erfolg wachsen können, wurde bewertet. Die Fähigkeit von Pilzen, Petrolatum zu nutzen, wurde als Unterschied im Koloniewachstum zwischen kontrolliertem BH und enthaltendem Petrolatum bewertet.
Fast 75% der getesteten Stämme waren in der Lage, Petrolatum als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, und 21% zeigten ein maximales Wachstum. Das Wachstum für Platten, die nur BHA und in Gegenwart von Motoröl enthielten, wurde ebenfalls überwacht. Fast 90% der Sorten wuchsen mit gebrauchtem Motoröl, wobei 39% ein maximales Wachstum zeigten.
Die Bildung eines rot-bräunlichen Halos um die Pilzkolonie deutete auf eine höhere Produktion von Laccasen und anderen ligninolytischen Enzymen hin. Etwa 60% der Pilze waren in der Lage, Laccases zu produzieren. Darüber hinaus erzeugten 17% der Stämme einen intensiven dunklen Heiligenschein um die Kolonie im Guaiacol-Medium.
Die Esterases-Aktivität wurde durch die Bildung eines weißen Niederschlags in Tween 80 Medium bewertet. Fast 60% der Stämme zeigten eine Esteraseaktivität und 13% zeigten eine höhere Niederschlagsbildung. Dieses Protokoll kann so angepasst werden, dass es nach Pilzen sucht, die in der Lage sind, Schadstoffe abzubauen, indem die widerspenstige Substanz von Interesse zu einem minimalen Kulturmedium hinzugefügt wird.
