פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מבודד זנים פטרייתיים בעלי פוטנציאל מתכלה גבוה ישירות מדגימות קרקע כדי להיחשב כמועמדים למטרות ביו-רמדיה. פרוטוקול זה הוא הקרנה בעלות נמוכה כדי למצוא פטריות עם פוטנציאל bioremediation. יתר על כן, הוא נותן תוצאות שקל לפרש.
מכיוון שטכניקה זו כוללת טיפול במיקרואורגניזמים, חשוב מאוד לעבוד בסטריליות באמצעות ארון זרימה למינרי או מבער בונזן כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, לדגום את הקרקע המעניינת ולסנן את הקרקע באמצעות רשת של שני מילימטרים כדי להסיר שורשים ופסולת צמחים. מתחת לארון זרימה למינרי, הוסיפו גרם אחד של האדמה המסוננת לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר.
לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטרים של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה כדי ליצור דילול של 10 למינוס אחד. לנער את הצינור אופקית במשך 30 דקות. לפני שהמתלים מתיישבים, קחו מיליליטר אחד של 10 לדילול מינוס אחד עם פיפטה סטרילית והעבירו אותה לתשעה מיליליטר של מים ריקים שעברו דה-יוניזציה כדי להפוך 10 לדילול מינוס שתיים.
מערבולת את המתלים ביסודיות. באופן דומה, בצעו דילול של 10 עד מינוס שלוש מ-10 לצינור דילול מינוס שתיים. לציפוי דילול קרקע על מדיה סלקטיבית, אספו 100 מיקרוליטרים מתוך 10 עד מינוס שלוש דילול באמצעות מיקרופיפט עם נקודה סטרילית והעבירו אותה לצלחת פטרי אגר הומי.
מפזרים את הדילול באופן שווה על משטח התבשיל באמצעות מפיץ תאים סטרילי, חד פעמי, בצורת L. הכינו ארבע עד חמש מנות כאלה. באופן דומה, הכינו מנות ליגנוצלולוז מצינור דילול של 10 עד מינוס שלוש.
אפשרו לכלים להתייבש באוויר במשך 10 עד 15 דקות לפני שהם דוגרים ב-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 15 יום. בדוק את כל המושבות הפטרייתיות הקיימות עבור דמיון. במידת הצורך, הכינו שקופית שתצפה תחת מיקרוסקופ אור.
מתחת לארון זרימה למינרי או במבער בונזן, יש לבודד כל זן פטרייתי שנבחר על ידי הסרה עדינה של חלק קטן מהתפטיר מהמושבה באמצעות מחט חיסון סטרילית. מעבירים את המושבה המבודדת לתבשיל חדש של תמצית מאלט, או MEA. מעבירים 20 מיליליטרים של בושנל האס, או מדיום BH, לבקבוקוני זכוכית של 50 מיליליטר.
מעבירים שבעה מיליליטרים של מים שעברו דה-יוניזציה לבקבוקונים של 15 מיליליטר ומוסיפים חתיכות של כיסוי זכוכית שבור לתוך כל בקבוקון. לעקר את הבקבוקונים על ידי אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי לבחון צמיחה על פטרולאטום, הוסיפו מיליליטר אחד של פטרולאטום לכל בקבוקון BH של 50 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית מתחת לארון הזרימה הלמינרי.
שמור כמה בקבוקונים עם רק BH כמו שליטה שלילית. הסר את התפטיר על פני השטח של המדיום מצלחת MEA עם הזן הפטרייתי שנבחר באמצעות מחט סטרילית והעביר אותו לבקבוקון זכוכית 15 מיליליטר עם החלקות הכיסוי השבורות. התסיסו את הבקבוקון על מערבל מערבולת במשך שתי דקות, ואפשרו לכיסוי השבור לחתוך את הקובייה של המושבה הפטרייתית, וליצור תרחיף.
חסן כל בקבוקון פטרולאטום עם מתלי 200 מיקרוליטרים. הכינו שני שכפולים לכל זן פטרייתי. עבור הבקרה השלילית, הוסף 200 microliters של תרחיף פטרייתי לתוך הבקבוקון המכיל רק BH בינוני.
כמו כן, לשמור את הבקבוקון עם petrolatum ללא כל חיסון פטרייתי כדי לבדוק זיהום במדיום. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהם לאחר 15 ו -30 יום מהאינקולום. כדי לבחון את הצמיחה בשמן מנוע משומש, העבירו 500 מיקרוליטרים של שמן מנוע משומש לצלחת BHA Petri ופיצו את השמן באופן שווה.
לאחר מכן, לחסן את הצלחת עם זן פטרייתי על ידי איסוף התפטיר מצלחות MEA. כדי לבחון את הגידול בפלסטיק, העבירו 200 מיקרוליטרים של תרחיף פטרייתי לצלחת של 96 מיקרו-וול. הכינו שלושה העתקים של שילוב הזן-פלסטיק הפטרייתי.
מוסיפים 10 מיליגרם של אבקת פלסטיק שונה לכל באר עם ההשעיה הפטרייתית. עבור הבקרה השלילית, הוסף 200 microliters של בינוני BH לבאר עם המתלים הפטרייתיים. יתר על כן, עבור כל אבקת פלסטיק, למלא באר עם 200 microliters של תמיסת BH ו 10 מיליגרם של כל אבק פלסטיק כדי לבדוק זיהום.
הדגירה של הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהן לאחר 15 ו-30 יום. לבדיקה קלורימטרית איכותית של לקאזות, הכינו ליטר אחד של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, או PDA, ואוטוקלב במשך 20 דקות. לאחר האוטוקלבינג, כאשר המדיום התקרר אך הוא עדיין נוזלי, מוסיפים 400 מיקרוליטרים של גואיאקול מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי ומצלחים אותו לתוך צלחות פטרי.
חסן את צלחת ה- PDA guaiacol במתח פטרייתי על ידי איסוף התפטיר מצלחת ה- MEA. לבקרות שליליות, הכינו צלחות PDA עם כל זן פטרייתי וצלחת אחת עם מחשב כף יד ו-guaiacol. דגירה של הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך וצפו בהן לאחר שבעה ימים.
למבחן האסטרזות האיכותיות, הכן ליטר אחד של Tween 80 בינוני. לאחר מכן, הניחו את המדיום על מערבל מגנטי ללא חימום עם מוט ערבוב בתוך המדיום. לאחר 10 דקות, כאשר הכל נמס, להעביר חמישה מיליליטרים של המדיום לתוך בקבוקונים סטריליים 20 מיליליטר ו autoclave.
הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תרחיף פטרייתי לבקבוקון המעוקר הבינוני Tween 80. עבור הבקרה השלילית, הוסף חמישה מיליליטרים של מדיום BH אוטוקלאב לתוך בקבוקון 20 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 microliters של תרחיף פטרייתי לבקבוקון.
דגירו את הבקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 21 יום וצפו בהם כל שבעה ימים. הוערך אחוז הזנים הפטרייתיים המסוגלים לגדול על בנזיןאטום, שמן מנוע משומש ואבקות פלסטיק כמקור הפחמן היחיד שלהם בדרגות שונות של הצלחה. היכולת של פטריות לנצל פטרולאטום הוערכה כהבדל בצמיחת המושבה בין BH מבוקר לבין מכיל פטרולאטום.
כמעט 75% מהזנים שנבדקו הצליחו להשתמש בפטרולאטום כמקור הפחמן היחיד שלהם ו-21% הציגו צמיחה מרבית. כמו כן מנוטר הגידול עבור לוחות המכילים רק BHA ובנוכחות שמן מנוע. כמעט 90% מהמאמצים גדלו על שמן מנוע משומש, כאשר 39% מהם הראו צמיחה מרבית.
היווצרותה של הילה אדומה-חומה סביב המושבה הפטרייתית הצביעה על ייצור גבוה יותר של לקאזות ואנזימים לינינוליטיים אחרים. כ-60% מהפטריות הצליחו לייצר לקאזות. יתר על כן, 17% מהזנים יצרו הילה כהה עזת סביב המושבה במדיום גואיאקול.
פעילות האסטרזות הוערכה על ידי היווצרות של משקע לבן במדיום Tween 80. כמעט 60% מהזנים הראו פעילות אסטרזות ו-13% הדגימו היווצרות משקעים גבוהה יותר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסינון פטריות המסוגלות להשפיל כל מזהם על ידי הוספת החומר הסרבן בעל העניין למדיום תרבות מינימלי.
