Questo protocollo è significativo perché isola ceppi fungini ad alto potenziale degradativo direttamente da campioni di suolo da considerare come candidati a fini di biorisanamento. Questo protocollo è uno screening a basso costo per trovare funghi con potenziale di biorisanamento. Inoltre, dà risultati facili da interpretare.
Poiché questa tecnica prevede la manipolazione di microrganismi, è molto importante lavorare in sterilità utilizzando un armadio a flusso laminare o un bruciatore Bunsen per evitare la contaminazione. Per iniziare, campionare il terreno di interesse e setacciare il terreno utilizzando una rete di due millimetri per rimuovere eventuali radici e detriti vegetali. Sotto un armadio a flusso laminare, aggiungere un grammo di terreno setacciato in un tubo sterile da 15 millilitri.
Quindi, aggiungere 10 millilitri di acqua deionizzata sterile per fare una diluizione da 10 a meno uno. Agitare il tubo orizzontalmente per 30 minuti. Prima che la sospensione si stabilizzi, prendere un millilitro di 10 alla diluizione meno uno con una pipetta sterile e trasferirlo in un bianco di nove millilitri di acqua deionizzata per fare 10 alla diluizione meno due.
Vortice la sospensione a fondo. Allo stesso modo, fai una diluizione da 10 a meno tre da un tubo di diluizione 10 a meno due. Per la placcatura delle diluizioni del terreno su mezzi selettivi, raccogliere 100 microlitri della diluizione da 10 a meno tre usando una micropipetta con un punto sterile e trasferirla su una capsula di Petri di agar umico.
Distribuire uniformemente la diluizione sulla superficie del piatto utilizzando uno spandicellulare sterile, monouso, a forma di L. Prepara da quattro a cinque di questi piatti. Allo stesso modo, preparare piatti di lignocellulosa da un tubo di diluizione 10 a meno tre.
Lasciare asciugare i piatti all'aria per 10-15 minuti prima di incubare a 25 gradi Celsius al buio per 15 giorni. Controlla tutte le colonie fungine presenti per somiglianze. Se necessario, preparare un vetrino da osservare al microscopio ottico.
Sotto un armadio a flusso laminare o in un bruciatore Bunsen, isolare ogni ceppo fungino scelto rimuovendo delicatamente una piccola parte del micelio dalla colonia con un ago di inoculazione sterile. Trasferire la colonia isolata in un nuovo piatto di estratto di malto agar o MEA. Trasferire 20 millilitri di Bushnell Haas, o mezzo BH, in flaconcini di vetro da 50 millilitri.
Trasferire sette millilitri di acqua deionizzata in flaconcini da 15 millilitri e aggiungere pezzi di coperchio di vetro rotto in ogni flaconcino. Sterilizzare i flaconcini in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Per testare la crescita sul petrolato, aggiungere un millilitro di petrolato a ogni flaconcino bh da 50 millilitri utilizzando una pipetta sterile sotto l'armadio a flusso laminare.
Conservare alcuni flaconcini con solo BH come controllo negativo. Rimuovere il micelio sulla superficie del mezzo dalla piastra MEA con il ceppo fungino scelto utilizzando un ago sterile e trasferirlo in un flaconcino di vetro da 15 millilitri con il coperchio rotto scivola. Agitare la fiala su un miscelatore a vortice per due minuti, lasciando scivolare il coperchio rotto per tagliare il cubo della colonia fungina, facendo una sospensione.
Inoculare ogni flaconcino di petrolato con sospensione da 200 microlitri. Fai due repliche per ogni ceppo fungino. Per il controllo negativo, aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina nel flaconcino contenente solo il mezzo BH.
Inoltre, tenere il flaconcino con petrolato senza alcuna inoculazione fungina per verificare la presenza di contaminazione nel mezzo. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo 15 e 30 giorni dall'inoculo. Per testare la crescita sull'olio motore usato, trasferire 500 microlitri di olio motore usato sulla capsula di Petri BHA e distribuire l'olio in modo uniforme.
Quindi, inoculare la piastra con ceppo fungino raccogliendo il micelio dalle piastre MEA. Per testare la crescita sulle materie plastiche, trasferire 200 microlitri di sospensione fungina in una piastra a 96 micro pozzetti. Fai tre repliche della combinazione ceppo-plastica fungina.
Aggiungere 10 milligrammi di una polvere di plastica diversa a ciascun pozzetto con la sospensione fungina. Per il controllo negativo, aggiungere 200 microlitri di mezzo BH al pozzo con la sospensione fungina. Inoltre, per ogni polvere di plastica, riempire un pozzo con 200 microlitri di soluzione bh e 10 milligrammi di ogni polvere di plastica per verificare la contaminazione.
Incubare le piastre a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo 15 e 30 giorni. Per il test calorimetrico qualitativo delle laccasi, preparare un litro di agar destrosio di patate, o PDA, e l'autoclave per 20 minuti. Dopo l'autoclave, quando il mezzo si è raffreddato ma è ancora liquido, aggiungere 400 microlitri di guaiacolo sotto una cappa a flusso laminare e inserirlo in piastre di Petri.
Inoculare la piastra di guaiacolo PDA con ceppo fungino raccogliendo il micelio dalla piastra MEA. Per i controlli negativi, preparare piastre PDA con ogni ceppo fungino e una piastra con PDA e guaiacolo. Incubare le piastre a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo sette giorni.
Per il test qualitativo delle esterasi, preparare un litro di Tween 80 medium. Quindi, posizionare il mezzo su un agitatore magnetico senza riscaldare con una barra di agitazione all'interno del mezzo. Dopo 10 minuti, quando tutto è fuso, trasferire cinque millilitri del mezzo in fiale sterili da 20 millilitri e autoclave.
Aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina al flaconcino sterilizzato medio Tween 80. Per il controllo negativo, aggiungere cinque millilitri di mezzo BH autoclavato in un flaconcino da 20 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina alla fiala.
Incubare le fiale a 25 gradi Celsius al buio per 21 giorni e osservarle ogni sette giorni. È stata valutata la percentuale di ceppi fungini in grado di crescere su petrolato, olio motore usato e polveri di plastica come unica fonte di carbonio con diversi gradi di successo. La capacità dei funghi di sfruttare il petrolato è stata valutata come la differenza nella crescita della colonia tra BH controllato e contenente petrolato.
Quasi il 75% dei ceppi testati è stato in grado di utilizzare il petrolato come unica fonte di carbonio e il 21% ha mostrato la massima crescita. È stata monitorata anche la crescita per le piastre contenenti solo BHA e in presenza di olio motore. Quasi il 90% dei ceppi è cresciuto con olio motore usato, con il 39% che ha mostrato la massima crescita.
La formazione di un alone rosso-brunastro intorno alla colonia fungina ha indicato una maggiore produzione di laccasi e altri enzimi ligninolitici. Circa il 60% dei funghi era in grado di produrre laccasi. Inoltre, il 17% dei ceppi ha prodotto un intenso alone scuro intorno alla colonia nel mezzo guaiacolo.
L'attività delle esterasi è stata valutata mediante la formazione di un precipitato bianco nel mezzo Tween 80. Quasi il 60% dei ceppi ha mostrato attività esterasi e il 13% ha dimostrato una maggiore formazione di precipitati. Questo protocollo può essere adattato per lo screening di funghi in grado di degradare qualsiasi inquinante aggiungendo la sostanza recalcitrante di interesse a un terreno di coltura minimo.
