يؤدي تلف سدى القرنية البالغة إلى استجابة سريعة لالتئام الجروح تعرض رؤية المرء للخطر بسبب تكوين أنسجة ندبة غير شفافة. يولد هذا البروتوكول جروحا في قرنيات الفرخ الجنينية التي على عكس البالغين ، يمكن أن تلتئم دون ندبة. بالنظر إلى القدرة الجوهرية للقرنية الجنينية المصابة على الخضوع لتلخيص كامل لبنية القرنية الأصلية دون أي ندوب يمكن اكتشافها ، فإن الفرخ الجنيني يخدم نموذجا حيوانيا مهما لتوضيح العوامل الجزيئية والخلوية لالتئام جروح القرنية بدون ندوب.
الجانب الأكثر تحديا في هذه التقنية هو توليد جرح ثابت يخترق كل من الظهارة الخارجية وسدى القرنية الأعمق. كما يتعلم المرء ، قد يكون من المفيد رؤية القرنيات المصابة في مقطع عرضي بحيث يمكن تقييم عمق اختراق الجرح في سدى القرنية. للبدء ، رتب البيض أفقيا على صينية ووضع علامة عليها في الجزء العلوي من البويضة للدلالة على الموضع المتوقع للجنين.
احتضن هذه البيض في حاضنة رطبة 38 درجة مئوية مع تنشيط وظيفة الهزاز. قم بإزالة البويضة من الحاضنة في اليوم الثالث من التطور الجنيني ووضعها أفقيا في حامل بيض آمن. قم بإنشاء ثقب صغير في الجزء العلوي من قشرة البيضة بالقرب من النهاية المدببة للبيضة باستخدام النهاية الحادة لمقص التشريح.
أدخل إبرة تحت الجلد مشطوفة بمقياس 18 من خلال الحفرة. مع دفع الإبرة إلى أسفل السطح الداخلي للبيضة والجانب المائل من الإبرة الذي يواجه الطرف المدبب للبيضة ، قم بإزالة اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من الألبومين من بيضة الدجاج وتخلص منها. نظف سطح قشر البيض المحيط بالثقب باستخدام مناديل خالية من الوبر ، مبللة قليلا بالإيثانول بنسبة 70٪ وامسحها جافة.
ختم الثقب المصنوع لإزالة الألبومين بشريط شفاف. مع النهاية الحادة لمقص التشريح ، قم بعمل ثقب نافذة ثان في الجزء العلوي من قشر البيض. تأكد من أن المقص لا يمتد بعيدا جدا في قشرة البيضة لتجنب ملامسة وإتلاف الجنين أو الأوعية الدموية الجنينية الموضوعة مباشرة أسفل جانب الثقب الثاني.
باستخدام ملقط منحني ، قم بتوسيع فتحة النافذة لتمتد بقطر يتراوح بين سنتيمترين وثلاثة سنتيمترات تقريبا للكشف عن الجنين النامي تحت القشرة والوصول إليه. الآن ، أدخل أحد طرفي الملقط في الحفرة ، مع إبقائه موازيا لقشر البيض ومتجاورا معه عن كثب. مع وضع نهاية الملقط الأخرى خارج قشر البيض ، قم بقرصة نهايتين الملقطتين بعناية معا ، مما يسمح لهما بكسر وإزالة قطع صغيرة من قشر البيض.
استمر في كسر وإزالة شظايا قشر البيض حتى تبقى نافذة من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تتراكب مباشرة على الجنين. للحد من التلوث البكتيري ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول الرنين الذي يحتوي على 50 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتومايسين من خلال ثقب النافذة. قم بإغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط لاصق شفاف.
قم بإجراء ختم البيض هذا عن طريق محاذاة زاوية من الشريط على المحور الطويل للثقب والضغط على الشريط إلى القشرة على بعد سنتيمتر إلى سنتيمترين من حافة الحفرة. استمر في الختم حول الفتحة حتى يتم ترك رفرف معلق من الشريط على جانب واحد. اضغط على قطعتي الشريط معا ، مما يخلق شكلا مقببا فوق الثقب واضغط على رفرف الشريط المتدلي على القشرة لإنهاء ختم البيضة.
أعد البيض ذو النوافذ إلى الحاضنة لمزيد من التطوير. تأكد من الحفاظ على هذه البيض أفقيا وإيقاف تشغيل وظيفة هزاز الحاضنات. استخدم مجهر تشريح للتأكد من أن الجنين في مرحلة النمو المناسبة وتحديد مواقع الغشاء السلوي والغشاء المشيمي.
ثم استخدم مقص تشريح دقيق معقم لقطع ثقب في الغشاء السلوي مباشرة فوق الطرف الأمامي الذي يمتد من الغشاء ، فوق الطرف الأمامي إلى الغشاء الذي يغطي الرأس. استخدم زوجين من الملقط المعقم الناعم وأمسك بالسلى بلطف في وضعين متجاورين بين الغشاء السلوي ACM والغشاء المشيمي. حرك بعناية كل زوج من الملقط ، وكلاهما يمسك الغشاء الأمنيوسي بقوة ، بعيدا عن بعضهما البعض مع تحرك زوج واحد ظهريا إلى الجنين والآخر بطنيا.
استخدم ملقط ناعم معقم لتشريح وإزالة أي غشاء أمنيون متبق يغطي الجنين. باستخدام ملقط معقم ، أمسك السلى بالقرب من منطقة منتصف الجمجمة من الجنين واسحب السلى بعناية في اتجاه مدلل فيما يتعلق بالجنين نحو الغشاء المشيمي النازح سابقا. أعد إغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط شفاف كما هو موضح في المخطوطة وأعد البيضة إلى الحاضنة لمزيد من التطوير.
قد تحتاج الأغشية الجنينية الإضافية إلى إعادة وضعها لضمان إمكانية الوصول إلى العين اليمنى. إذا لم يكن بالإمكان الوصول إلى العين اليمنى للجرح بسبب وضع الجنين في البويضة ، فيمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم غير مصاب. استخدم سكين تشريح دقيق لإجراء شق يمتد على مدى قرنية العين اليمنى التي تكون موازية ومضمنة مع الأنسجة المشيمية وتتماشى معها.
استخدم سكين التشريح الدقيق مرة أخرى ، لتمزيق القرنية في نفس مكان الشق الأول ، مرتين أكثر بطريقة تجعل قطع اثنين وقطع ثلاثة يحدث جنبا إلى جنب مع نفس الوضع في القرنية مثل قطع واحد. للمساعدة في الجدوى، استخدم ملقط القزحية المنحني لثني الجنين مرة أخرى تحت الغشاء المشيمي بعد الجراحة لتعزيز النمو السليم للغشاء المشيمي. بعد ذلك ، أضف ثلاث إلى أربع قطرات من محلول الرنين الذي يحتوي على مضادات حيوية لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
أعد إغلاق فتحة النافذة بشريط شفاف والعودة إلى الحاضنة ، تاركا البيضة أفقية. اسمح للجنين بالتطور وجرح القرنية بالشفاء للفترة المطلوبة. بعد الحضانة ، قم بالقتل الرحيم للجنين واستخدام ملقط القزحية المنحني لحصاد العين في طبق بتري من محلول رينجر الملحي عن طريق الإمساك بالعين بلطف على جانبها الخلفي حيث تلتقي العين وأنسجة الوجه ورفع العين بالكامل بعناية بعيدا وخالية من أنسجة الوجه.
استخدم ملقط ناعم لكزة ثقب صغير من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات في الجزء الخلفي من العين بأكملها وإصلاح العين بأكملها في 4٪ بارافورمالديهايد عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع إثارة خفيفة. لتحقيق جرح مثالي ، من الأهمية بمكان استخدام سكين تشريح دقيق حاد وتطبيق الكمية الصحيحة من الضغط أثناء التمزق. سيؤدي تطبيق ضغط قليل جدا إلى جرح ضحل يمزق ظهارة القرنية دون اختراق السدى الأمامي بشكل كاف.
يؤدي تطبيق الكثير من الضغط إلى جرح كامل المدى يخترق السدى بأكمله ويعرض الفكاهة المائية للبيئة الخارجية. ينتج عن إجراء شقوق التمزق المناسبة جرحا مثاليا يوسع في البداية من صفر إلى ثلاثة أيام بعد الجرح. بعد ذلك ، تحدث إعادة الظهارة وتكوين أنسجة جديدة لإغلاق الجرح في النهاية بطريقة خالية من الندوب لمدة 11 يوما ، بعد الجرح.
تم العثور على التوطين الزماني المكاني لبروتينات المصفوفة خارج الخلية ، والفيبرونيكتين وتيناسين داخل الجرح الشافي مرتفعا في نقاط زمنية تتوافق مع إعادة ظهارة القرنية ، مما يشير إلى مشاركتها في إغلاق الجرح ، وهجرة الخلايا الظهارية والبقاء على قيد الحياة. كشفت الكيمياء النسيجية المناعية الكاملة أن الأعصاب التي تجاور القرنية المركزية المصابة مباشرة يتم تثبيطها مؤقتا من أنسجة القرنية الشافية. على الرغم من التثبيط السابق ، فإن أعصاب القرنية في النهاية تعصب أنسجة القرنية الملتئمة بالكامل بعد 11 يوما من الجرح إلى مستويات كثافة مماثلة وفي أنماط مماثلة للمرحلة المتطابقة غير الجريحة التي تسيطر عليها في اليوم الجنيني 18.
كما يتضح من الجيل الثاني من التصوير التوافقي ، ينظر إلى حزم من ألياف الكولاجين عبر أعماق مختلفة من جرح القرنية المركزي مرتبة بشكل متعامد ، مطابقة للبنية الكلية الأصلية لأنسجة القرنية المركزية غير المصابة. عندما يقترن هذا النموذج الحيواني بنهج البيولوجيا التنموية الكلاسيكية ، مثل تطعيم الأنسجة وزرع الخرز ، بالإضافة إلى نهج العصر الحديث للتلاعب بالجينات مثل العدوى الفيروسية القهقرية وكهربية الحمض النووي ، يعد هذا النموذج الحيواني بالكشف عن العوامل الجزيئية والآليات الخلوية اللازمة لتعزيز التئام جروح القرنية بدون ندبات. إن تحديد العوامل الجزيئية الرئيسية في بروتينات المصفوفة التي تنظم التئام الجروح الجنيني بدون ندوب سيمهد الطريق للعلاجات التي تعزز عملية شفاء أكثر تصالحية مع تندب أقل وتلخيص أفضل لبنية الأنسجة الطبيعية.
