Повреждение стромы роговицы у взрослых приводит к быстрой реакции заживления ран, которая ставит под угрозу зрение из-за образования непрозрачной рубцовой ткани. Этот протокол генерирует раны в эмбриональных роговицах цыплят, которые, в отличие от взрослых, могут заживать без шрама. Учитывая внутреннюю способность поврежденной эмбриональной роговицы подвергаться полному рекапитуляции нативной структуры роговицы без обнаружения рубцов, эмбриональный птенец служит важной животной моделью для выяснения молекулярных и клеточных факторов заживления ран роговицы без шрамов.
Наиболее сложным аспектом этой техники является создание последовательной раны, которая проникает как в самый внешний эпителий, так и в более глубокую строму роговицы. По мере обучения может быть полезно рассмотреть раненую роговицу в поперечном сечении, чтобы можно было оценить глубину проникновения раны в строму роговицы. Для начала расположите яйца горизонтально на лотке и отметьте их в верхней части яйца, чтобы обозначить ожидаемое положение эмбриона.
Инкубируйте эти яйца в увлажненном инкубаторе с температурой 38 градусов Цельсия с активированной функцией раскачивания. Извлеките яйцеклетку из инкубатора на третий день эмбрионального развития и расположите ее горизонтально в надежном держателе яиц. Создайте небольшое отверстие в верхней части яичной скорлупы возле заостренного конца яйца, используя острый конец рассекающих ножниц.
Вставьте скошенную иглу для подкожных инъекций 18 калибра через отверстие. Прижав иглу к нижней части внутренней поверхности яйца и скосовой стороне иглы, обращенной к заостренному концу яйца, удалите два-три миллилитра альбумина из куриного яйца и выбросьте. Очистите поверхность яичной скорлупы, окружающую отверстие, безворсовыми салфетками, слегка смочите 70% этанолом и вытрите насухо.
Запечатайте отверстие, предназначенное для удаления альбумина, прозрачной лентой. Острым концом рассекают ножницы, делают второе оконное отверстие в верхней части яичной скорлупы. Убедитесь, что ножницы не простираются слишком далеко в яичную скорлупу, чтобы избежать контакта и повреждения эмбриона или эмбриональной сосудистой системы, расположенной непосредственно под стороной второго отверстия.
Используя изогнутые щипцы, расширьте оконное отверстие, чтобы охватить примерно два-три сантиметра в диаметре, чтобы выявить и получить доступ к развивающемуся эмбриону под оболочкой. Теперь вставьте один конец щипцов в отверстие, сохраняя его параллельным и тесно сопоставленным с яичной скорлупой. Когда конец других щипцов расположен за пределами яичной скорлупы, осторожно зажмите два конца щипцов вместе, позволяя им сломать и удалить небольшие кусочки яичной скорлупы.
Продолжайте разбивать и удалять фрагменты яичной скорлупы до тех пор, пока не останется двух-трехсантиметровое окно, которое непосредственно накладывается на эмбрион. Чтобы ограничить бактериальное загрязнение, добавьте через оконное отверстие от 100 до 200 микролитров раствора рингера, содержащего 50 единиц на миллилитр пенициллина и 50 микрограммов на миллилитр стрептомицина. Закройте отверстие в окне с помощью прозрачной клейкой ленты.
Выполните это уплотнение яйца, выровняв угол ленты по длинной оси отверстия и прижав ленту к скорлупе на расстоянии одного-двух сантиметров от края отверстия. Продолжайте герметизацию вокруг отверстия до тех пор, пока с одной стороны не останется висячий клапан ленты. Прижмите два куска ленты вместе, создав куполообразную форму над отверстием, и прижмите лоскут нависающей ленты к скорлупе, чтобы закончить запечатывание яйца.
Верните оконные яйца в инкубатор для дальнейшего развития. Убедитесь, что эти яйца находятся горизонтально и выключают функцию раскачивания инкубаторов. Используйте рассекающий микроскоп, чтобы убедиться, что эмбрион находится на правильной стадии развития, и определить положения амниохорионной мембраны и хориоаллантоической мембраны.
Затем используйте стерилизованные микродиссекционные ножницы, чтобы вырезать отверстие в амниохорионной мембране непосредственно над передней конечностью, которая простирается от мембраны, перекрывая переднюю часть до мембраны, покрывающей голову. Используйте две пары тонких стерильных щипцов и осторожно захватите амнион в двух соседних положениях между амниохорионной мембраной ACM и хориоаллантойной мембраной. Осторожно переместите каждую пару щипцов, которые крепко захватывают амниотическую мембрану, подальше друг от друга, причем одна пара движется дорсально к эмбриону, а другая вентрально.
Используйте стерилизованные тонкие щипцы для рассечения и удаления оставшейся амнионной мембраны, покрывающей эмбрион. Используя стерилизованные щипцы, захватите амнион около средней черепной области эмбриона и осторожно потяните амнион в направлении по отношению к эмбриону к ранее смещенной хориоаллантоической мембране. Повторно запечатайте оконное отверстие с помощью прозрачной ленты, как описано в рукописи, и верните яйцо в инкубатор для дальнейшего развития.
Дополнительные эмбриональные мембраны, возможно, потребуется переместить, чтобы обеспечить доступность правого глаза. Если правый глаз недоступен для ранения из-за положения эмбриона в яйцеклетке, он может служить нераненым контролем. Используйте нож для микропарирования, чтобы сделать разрез, который охватывает протяженность роговицы правого глаза, которая параллельна и соответствует ткани сосудистой оболочки.
Используйте микропарирующий нож, чтобы снова разорвать роговицу в том же месте, что и первый разрез, в два раза больше таким образом, чтобы разрезать два и разрезать три, происходящих вместе с тем же положением в роговице, что и разрезанный один. Чтобы помочь с жизнеспособностью, используйте изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы заправить эмбрион обратно под хориоаллантоическую мембрану после операции, чтобы способствовать правильному росту хориоаллантоической мембраны. Затем добавьте три-четыре капли раствора рингера, содержащего антибиотики, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
Запечатайте отверстие в окне прозрачной лентой и вернитесь в инкубатор, оставив яйцо горизонтальным. Позвольте эмбриону развиться, а ране роговицы зажить в течение желаемого периода. После инкубации усыпьте эмбрион и используйте изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы собрать глаз в чашке Петри из физиологического раствора Рингера, осторожно захватив глаз на его задней стороне, где встречаются глаз и лицевые ткани, и осторожно подняв весь глаз и освободившись от ткани лица.
Используйте тонкие щипцы, чтобы проткнуть небольшое отверстие от трех до пяти сантиметров в задней части всего глаза и зафиксировать весь глаз в 4% параформальдегиде при четырех градусах Цельсия в течение ночи с легким перемешиванием. Для достижения идеальной раны крайне важно использовать острый нож для микродисперсирования и применять правильное количество давления во время рваной раны. Применение слишком малого давления приведет к неглубокой ране, которая разрывает эпителий роговицы без достаточного проникновения в переднюю строму.
Применение слишком большого давления приводит к тому, что рана в полной мере проникает во всю строму и подвергает водную влагу внешней среде. Проведение правильных рваных разрезов создает идеальную рану, которая первоначально увеличивается от нуля до трех дней после ранения. После этого происходит реэпителизация и образование новых тканей, чтобы в конечном итоге закрыть рану без шрамов на 11 дней, после ранения.
Было обнаружено, что пространственно-временная локализация белков внеклеточного матрикса, фибронектина и тенасцина в заживающей ране повышена во временных точках, соответствующих реэпителизации роговицы, что свидетельствует об их участии в закрытии раны, миграции эпителиальных клеток и выживаемости. Иммуногистохимия всей горы показала, что нервы, которые непосредственно сопоставляли раненую центральную роговицу, временно ингибируются из заживающей ткани роговицы. Несмотря на более раннее торможение, нервы роговицы в конечном итоге иннервируют полностью зажившую ткань роговицы через 11 дней после ранения до аналогичных уровней плотности и в аналогичных паттернах, чтобы соответствовать стадиям нераненой контрольной группы эмбрионального 18-го дня.
Как свидетельствует гармоническая визуализация второго поколения, пучки коллагеновых волокон на различной глубине раны центральной роговицы расположены ортогонально, что соответствует нативной макроструктуре нераненой ткани центральной роговицы. В сочетании с классическими подходами биологии развития, такими как пересадка тканей и имплантация бусин, а также современными подходами к генным манипуляциям, таким как ретровирусная инфекция и электропорация ДНК, эта животная модель обещает выявить молекулярные факторы и клеточные механизмы, необходимые для содействия заживлению ран роговицы без шрамов. Определение ключевых молекулярных факторов в матричных белках, которые регулируют заживление ран плода без рубцов, проложит путь для терапии, которая способствует более восстановительному процессу заживления с меньшим количеством рубцов и лучшей рекапитуляцией нормальной тканевой архитектуры.
