성인 각막 스트로마의 손상은 불투명 한 흉터 조직 형성으로 인해 시력을 손상시키는 빠른 상처 치유 반응으로 이어집니다. 이 프로토콜은 성인과 달리 흉터없이 치유 할 수있는 배아 병아리 각막에 상처를 생성합니다. 부상당한 배아 각막이 검출 가능한 흉터없이 네이티브 각막 구조의 완전한 재회생을 겪을 수있는 고유 한 능력을 감안할 때, 배아 병아리는 흉터가없는 각막 상처 치유를위한 분자 및 세포 요인을 밝히는 중요한 동물 모델을 제공합니다.
이 기술의 가장 도전적인 측면은 가장 바깥 쪽 상피와 더 깊은 각막 기질을 관통하는 일관된 상처를 생성하는 것입니다. 학습하는 동안, 상처 입은 각막을 횡단면으로 보면서 각막 기질로의 상처 침투 깊이를 평가할 수 있도록하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 난자를 트레이에 수평으로 배열하고 난자의 상단에 표시하여 배아의 예상 위치를 나타냅니다.
이 알을 섭씨 38도 가습 인큐베이터에서 흔들기 기능이 활성화 된 상태로 배양하십시오. 배아 발달 셋째 날에 인큐베이터에서 난자를 제거하고 안전한 난자 홀더에 수평으로 놓습니다. 해부하는 가위의 날카로운 끝을 사용하여 달걀의 뾰족한 끝 근처의 달걀 껍질 꼭대기에 작은 구멍을 만듭니다.
구멍을 통해 18게이지 비스듬한 피하 주사 바늘을 삽입합니다. 바늘을 계란의 안쪽 표면의 바닥과 바늘의 경사면이 계란의 뾰족한 끝을 향하게하여 닭고기 달걀에서 알부민 두 세 밀리리터를 제거하고 버립니다. 보풀이없는 물티슈로 구멍을 둘러싼 달걀 껍질 표면을 닦고 70 % 에탄올로 가볍게 적신 다음 말리십시오.
알부민을 제거하기 위해 만든 구멍을 투명한 테이프로 밀봉하십시오. 가위를 해부하는 날카로운 끝으로 달걀 껍질 꼭대기에 두 번째 창문 구멍을 만드십시오. 가위가 달걀 껍질까지 너무 멀리 확장되지 않도록 하여 두 번째 구멍의 측면 바로 아래에 위치한 배아 또는 배아 혈관구조가 접촉하거나 손상되지 않도록 하십시오.
구부러진 포셉을 사용하여 창 구멍을 넓혀 직경이 약 두세 센티미터에 걸쳐 쉘 아래의 발달하는 배아를 드러내고 접근합니다. 이제 포셉의 한쪽 끝을 구멍에 삽입하여 달걀 껍질과 평행하고 밀접하게 병치시킵니다. 달걀 껍질 바깥쪽에 다른 포셉 끝이 놓인 상태에서 두 포셉 끝을 조심스럽게 꼬집어 달걀 껍질의 작은 조각을 부수고 제거 할 수 있습니다.
배아를 직접 오버레이하는 두세 센티미터의 창이 남을 때까지 달걀 껍질 조각을 계속 부수고 제거하십시오. 박테리아 오염을 제한하려면 페니실린 밀리리터 당 50 단위, 스트렙토 마이신 밀리리터 당 50 마이크로 그램을 포함하는 링거 용액 100 ~ 200 마이크로 리터를 창 구멍을 통해 첨가하십시오. 투명 접착 테이프를 사용하여 창 구멍을 밀봉하십시오.
테이프의 모서리를 구멍의 긴 축에 맞추고 테이프를 구멍 가장자리에서 한 두 센티미터 떨어진 셸에 눌러 이 달걀 밀봉을 수행합니다. 매달린 테이프 플랩이 한쪽에 남을 때까지 개구부 주위를 밀봉을 계속하십시오. 두 개의 테이프를 함께 눌러 구멍 위에 돔형 모양을 만들고 돌출 된 테이프의 플랩을 껍질에 눌러 계란 밀봉을 마칩니다.
추가 개발을 위해 창문이 달린 알을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 이 알을 수평으로 유지하고 인큐베이터 흔들기 기능을 끄십시오. 해부 현미경을 사용하여 배아가 적절한 발달 단계에 있는지 확인하고 양수 이온막과 chorioallantoic 막의 위치를 찾으십시오.
그런 다음 멸균 된 마이크로 해부 가위를 사용하여 막에서 연장되는 앞다리 바로 위의 양수 이온성 막의 구멍을 자르고 앞다리를 머리 위에 놓는 막까지 놓습니다. 두 쌍의 미세한 멸균 포셉을 사용하고 양수 이온성 막 ACM과 chorioallantoic 막 사이의 두 개의 인접한 위치에서 양수를 부드럽게 잡으십시오. 조심스럽게 양막을 단단히 잡고있는 각 포셉 쌍을 서로 멀어지게하고 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 심실로 움직입니다.
멸균 된 미세 포셉을 사용하여 배아를 덮고있는 남아있는 양막을 해부하고 제거하십시오. 멸균 된 포셉을 사용하여 배아의 중간 두개골 영역 근처의 양수를 잡고 배아에 대한 양수를 조심스럽게 잡아 당겨 초기 변위 된 chorioallantoic 막쪽으로 당깁니다. 원고에 설명 된대로 투명 테이프를 사용하여 창 구멍을 다시 밀봉하고 추가 개발을 위해 계란을 인큐베이터로 되돌립니다.
여분의 배아 막은 오른쪽 눈이 접근 할 수 있도록 재배치해야 할 수도 있습니다. 오른쪽 눈이 난자에서 배아의 위치로 인해 상처에 접근 할 수 없다면, 상처가없는 대조군으로 작용할 수 있습니다. 마이크로 해부 칼을 사용하여 맥락막 조직과 평행하고 인라인되는 오른쪽 눈의 각막의 정도에 걸친 절개를 만드십시오.
마이크로 해부 나이프를 사용하여 다시 첫 번째 절개와 같은 지점에 각막을 레이스 시키고, 두 번 더 자르고 각막에서 동일한 위치와 함께 발생하는 세 개를 자르는 방식으로 두 번 더 자릅니다. 생존력을 돕기 위해, 곡선 홍채 포셉을 사용하여 수술 후 맥락 알란토익 막 아래에 배아를 다시 집어 넣어 맥락 알란토익 막의 적절한 성장을 촉진하십시오. 다음으로, 항생제가 들어있는 링거 용액 서너 방울을 첨가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
투명 테이프로 창문 구멍을 다시 밀봉하고 인큐베이터로 돌아가서 계란을 수평으로 남겨 둡니다. 배아가 발달하고 각막 상처가 원하는 기간 동안 치유되도록하십시오. 배양 후, 배아를 안락사시키고 곡선 홍채 포셉을 사용하여 눈과 얼굴 조직이 만나는 후방의 눈을 부드럽게 잡고 조심스럽게 전체 눈을 들어 올려 얼굴 조직에서 자유로워서 링거 식염수의 페트리 접시에서 눈을 수확합니다.
미세한 포셉을 사용하여 전체 눈 뒤쪽에 서너 ~ 다섯 센티미터의 작은 구멍을 찌르고 가벼운 동요로 밤새 섭씨 4도에서 4 % 파라 포름 알데히드로 전체 눈을 고정하십시오. 이상적인 상처를 얻으려면 날카로운 마이크로 해부 나이프를 사용하고 열상 중에 정확한 양의 압력을 가하는 것이 중요합니다. 너무 적은 압력을 가하면 전방 스트로마를 충분히 관통하지 않고 각막 상피를 찢는 얕은 상처가 생깁니다.
너무 많은 압력을 가하면 전체 스트로마에 침투하여 수성 유머가 외부 환경에 노출되는 전체 상처가 발생합니다. 적절한 레이스 절개를 수행하면 상처 후 처음에는 0에서 사흘까지 확대되는 이상적인 상처가 생깁니다. 그 후, 재상피화 및 새로운 조직 형성이 일어나 궁극적으로 상처 후 11일까지 흉터가 없는 방식으로 상처를 닫는다.
치유 상처 내의 세포외 매트릭스 단백질, 피브로넥틴 및 테나신의 시공간 국소화는 각막 재상피화에 상응하는 시점에서 상승되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 상처 폐쇄, 상피 세포 이동 및 생존에 대한 이들의 관여를 시사한다. 전체 마운트 면역 조직 화학은 상처 입은 중앙 각막을 직접 병치시킨 신경이 치유 각막 조직에서 일시적으로 억제된다는 것을 밝혀 냈습니다. 이전의 억제에도 불구하고, 각막 신경은 결국 상처 후 11일 후에 완전히 치유된 각막 조직을 유사한 밀도 수준으로 신경질화시키고 유사한 패턴으로 병상 비상처 대조군 배아 18일째에 매칭한다.
두 번째 세대의 고조파 영상에 의해 입증 된 바와 같이, 중앙 각막 상처의 다양한 깊이에 걸쳐 콜라겐 섬유의 다발이 직교로 배열되어 상처받지 않은 중앙 각막 조직의 기본 매크로 구조와 일치합니다. 조직 이식 및 비드 이식과 같은 고전적인 발달 생물학 접근법뿐만 아니라 레트로 바이러스 감염 및 DNA 전기 천공과 같은 유전자 조작에 대한 현대의 접근법과 결합 될 때,이 동물 모델은 흉터가없는 각막 상처 치유를 촉진하는 데 필요한 분자 요인 및 세포 메커니즘을 밝힐 것을 약속합니다. 태아 흉터없는 상처 치유를 조절하는 매트릭스 단백질의 핵심 분자 인자를 결정하는 것은 흉터가 적고 정상 조직 구조의 더 나은 회복으로보다 회복적인 치유 과정을 촉진하는 치료법의 길을 열어 줄 것입니다.
