Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Yetişkin kornea stromasındaki hasar, opak skar dokusu oluşumu nedeniyle kişinin görüşünü tehlikeye atan hızlı bir yara iyileşmesi tepkisine yol açar. Bu protokol, embriyonik civciv kornealarında, yetişkinlerin aksine, yara izi olmadan iyileşebilen yaralar oluşturur. Yaralı embriyonik korneanın, saptanabilir bir yara izi olmadan doğal kornea yapısının tam bir özetine maruz kalma içsel kapasitesi göz önüne alındığında, embriyonik civciv, yarasız kornea yarasının iyileşmesi için moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için önemli bir hayvan modeline hizmet eder.

Bu tekniğin en zorlu yönü, hem en dış epiteli hem de daha derin kornea stromasını delen tutarlı bir yara oluşturmaktır. Öğrenilirken, yaralı korneaları bir kesitte görmek yararlı olabilir, böylece kornea stromasına yara penetrasyonunun derinliği değerlendirilebilir. Başlamak için, yumurtaları yatay olarak bir tepsiye yerleştirin ve embriyonun beklenen konumunu belirtmek için yumurtanın üstünde işaretleyin.

Bu yumurtaları, sallanma fonksiyonu etkinleştirilerek 38 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Embriyonik gelişimin üçüncü gününde yumurtayı inkübatörden çıkarın ve yatay olarak güvenli bir yumurta tutucuya yerleştirin. Diseksiyon makasının keskin ucunu kullanarak yumurta kabuğunun üst kısmında, yumurtanın sivri ucuna yakın küçük bir delik oluşturun.

Delikten 18 gauge eğimli hipodermik iğne yerleştirin. İğne yumurtanın iç yüzeyinin dibine ve iğnenin eğim tarafı yumurtanın sivri ucuna bakacak şekilde itilirken, albüminin iki ila üç mililitresini tavuk yumurtasından çıkarın ve atın. Deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyini,% 70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle temizleyin ve kurulayın.

Albümini çıkarmak için yapılan deliği şeffaf bantla kapatın. Diseksiyon masasının keskin ucuyla, yumurta kabuğunun üstünde ikinci bir pencere deliği açın. Makasların, ikinci deliğin hemen altına yerleştirilmiş embriyo veya embriyonik vaskülatürün temas etmesini ve zarar görmesini önlemek için yumurta kabuğuna çok fazla uzanmadığından emin olun.

Kavisli forseps kullanarak, kabuğun altındaki gelişmekte olan embriyoyu ortaya çıkarmak ve bunlara erişmek için pencere deliğini yaklaşık iki ila üç santimetre çapında olacak şekilde genişletin. Şimdi, forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar.

Embriyoyu doğrudan kaplayan iki ila üç santimetrelik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin. Bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, pencere deliğinden mililitre penisilin başına 50 birim ve mililitre streptomisin başına 50 mikrogram içeren 100 ila 200 mikrolitre zil çözeltisi ekleyin. Pencere deliğini şeffaf yapışkan bant kullanarak kapatın.

Bu yumurta sızdırmazlığını, bandın bir köşesini deliğin uzun eksenine hizalayarak ve bandı deliğin kenarından bir ila iki santimetre uzaktaki kabuğa bastırarak gerçekleştirin. Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için çıkıntılı bant kapağını kabuğa bastırın.

Daha fazla gelişme için pencereli yumurtaları inkübatöre iade edin. Bu yumurtaları yatay tuttuğunuzdan emin olun ve inkübatörlerin sallanma işlevini kapatın. Embriyonun uygun gelişim aşamasında olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskobu kullanın ve amniyotoryonik membranın ve koryoalantoik membranın konumlarını bulun.

Daha sonra, amniyotoryonik membranda, membrandan uzanan ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın. İki çift ince steril forseps kullanın ve amniyoniği amniyotiyonik membran ACM ile koryoallantoik membran arasındaki iki bitişik pozisyonda yavaşça tutun. Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğer ventralal olarak hareket ederek birbirinden uzaklaştırın.

Embriyoyu kaplayan kalan amniyon zarını diseke etmek ve çıkarmak için sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha erken yer değiştirmiş koryoallantoik membrana doğru dikkatlice bir coddle yönünde çekin. Pencere deliğini el yazmasında açıklandığı gibi şeffaf bant kullanarak yeniden kapatın ve daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin.

Sağ gözün erişilebilir olmasını sağlamak için ekstra embriyonik membranların yeniden konumlandırılması gerekebilir. Embriyonun yumurtadaki konumu nedeniyle sağ göze yaralama için erişilebilir değilse, yaralanmamış bir kontrol görevi görebilir. Koroid dokuya paralel ve aynı hizada olan sağ gözün kornea derecesini kapsayan bir kesi yapmak için mikro diseksiyon bıçağı kullanın.

Mikro diseksiyon bıçağını tekrar kullanın, korneayı ilk kesi ile aynı noktada, iki kat daha fazla olacak şekilde bağlayın, böylece iki ve üç kesim korneada aynı pozisyonda bir kesilen olarak meydana gelir. Canlılığa yardımcı olmak için, korioallantoik membranın düzgün büyümesini teşvik etmek için ameliyattan sonra embriyoyu koryoallantoik membranın altına geri çekmek için kavisli iris forsepslerini kullanın. Daha sonra, embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için antibiyotik içeren üç ila dört damla ringer çözeltisi ekleyin.

Pencere deliğini şeffaf bantla tekrar kapatın ve yumurtayı yatay bırakarak inkübatöre geri dönün. Embriyonun gelişmesine ve kornea yarasının istenen bir süre iyileşmesine izin verin. Kuluçkadan sonra, embriyoyu ötenazi yapın ve gözü Ringer'ın tuzlu su çözeltisinin Petri kabında toplamak için kavisli iris forseps kullanın, gözü göz ve yüz dokusunun buluştuğu arka tarafındaki gözü hafifçe kavrayarak ve tüm gözü dikkatlice kaldırarak yüz dokusundan arındırın.

Tüm gözün arkasında üç ila beş santimetrelik küçük bir delik açmak için ince forseps kullanın ve tüm gözü hafif ajitasyonla gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. İdeal bir yara elde etmek için, keskin bir mikro diseksiyon bıçağı kullanmak ve yırtılma sırasında doğru miktarda basınç uygulamak çok önemlidir. Çok az basınç uygulamak, anterior stromaya yeterince nüfuz etmeden kornea epitelini yırtan sığ bir yaraya neden olacaktır.

Çok fazla basınç uygulanması, tüm stromaya nüfuz eden ve sulu mizahı dış ortama maruz bırakan tam ölçüde bir yara ile sonuçlanır. Uygun yırtıcı insizyonların yapılması, başlangıçta yaralamadan sonra sıfır ila üç gün içinde genişleyen ideal bir yara üretir. Bundan sonra, yeniden epitelizasyon ve yeni doku oluşumu, yarayı yara sonrası 11 gün boyunca yara izi bırakmadan kapatmak için meydana gelir.

İyileşen yara içindeki hücre dışı matriks proteinleri, fibronektin ve tenassinin spatiotemporal lokalizasyonunun, kornea yeniden epitelizasyonuna karşılık gelen zaman noktalarında yükseldiği ve yara kapanması, epitel hücre göçü ve sağkalımına dahil olduklarını düşündürdüğü bulunmuştur. Tüm mount immünohistokimyası, yaralı merkezi korneayı doğrudan yan yana getiren sinirlerin, iyileşen kornea dokusundan geçici olarak inhibe edildiğini ortaya koymuştur. Daha önceki inhibisyona rağmen, kornea sinirleri sonunda tamamen iyileşmiş kornea dokusunu yaralamadan 11 gün sonra benzer yoğunluk seviyelerine ve benzer modellerde yaralı olmayan kontrollerin embriyonik 18. gününe kadar innerve eder.

İkinci jenerasyon harmonik görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, santral kornea yarasının değişen derinlikleri boyunca kollajen lif demetleri, yaralanmamış merkezi kornea dokusunun doğal makro yapısına uyan ortogonal olarak düzenlenmiş olarak görülür. Doku greftleme ve boncuk implantasyonu gibi klasik gelişimsel biyoloji yaklaşımlarının yanı sıra retroviral enfeksiyon ve DNA elektroporasyonu gibi gen manipülasyonu için günümüz yaklaşımlarıyla birleştirildiğinde, bu hayvan modeli, skarsız kornea yarasının iyileşmesini teşvik etmek için gerekli moleküler faktörleri ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmayı vaat ediyor. Fetal skarsız yara iyileşmesini düzenleyen matriks proteinlerinde anahtar moleküler faktörlerin belirlenmesi, daha az yara izi ve normal doku mimarisinin daha iyi özetlenmesi ile daha restoratif bir iyileşme sürecini teşvik eden tedavilerin yolunu açacaktır.