成人の角膜間質の損傷は、不透明な瘢痕組織形成のために視力を損なう急速な創傷治癒反応をもたらす。このプロトコルは、成人とは異なり、瘢痕なしで治癒することができる胚性ひよこ角膜に創傷を生成する。損傷した胚性角膜が、検出可能な瘢痕化なしに天然の角膜構造の完全な反復を受ける固有の能力を考えると、胚性ひよこは、瘢痕のない角膜創傷治癒のための分子および細胞因子を解明するための重要な動物モデルに役立つ。
この技術の最も困難な側面は、最も外側の上皮とより深い角膜間質の両方を貫通する一貫した創傷を生成することである。学習しているときに、角膜間質への創傷浸透の深さを評価できるように、創傷角膜を断面で見ることが役立つかもしれません。まず、卵をトレイに水平に配置し、卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。
これらの卵を摂氏38度の加湿インキュベーターで孵化させ、ロッキング機能を作動させます。胚発生の3日目に卵をインキュベーターから取り出し、安全な卵ホルダーに水平に置きます。解剖ハサミの鋭い端を使用して、卵の尖った端の近くに卵殻の上部に小さな穴を開けます。
18ゲージの斜めの皮下注射針を穴に挿入します。針を卵の内面の底に押し込み、針の斜め側を卵の尖った端に向け、鶏の卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを取り出して捨てます。糸くずの出ないワイプで穴を囲む卵殻の表面をきれいにし、70%エタノールで軽く湿らせて乾かします。
アルブミンを除去するために作った穴を透明なテープで密封します。解剖ハサミの鋭い端で、卵殻の上部に2番目の窓の穴を開けます。はさみが卵殻に伸びすぎないようにして、2番目の穴の側面のすぐ下に位置する胚または胚性血管系に接触して損傷しないようにします。
湾曲した鉗子を使用して、窓の穴を直径約2〜3センチメートルに広げ、殻の下の発達中の胚を明らかにしてアクセスさせます。次に、鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、密接に並置します。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。
胚を直接覆う2〜3センチメートルの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。細菌汚染を制限するために、ペニシリン1ミリリットルあたり50単位およびストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む100〜200マイクロリットルのリンガー溶液を窓の穴から加える。窓の穴は透明な粘着テープでシールします。
この卵のシールを行うには、テープの角を穴の長軸に合わせ、穴の端から1〜2センチメートル離れたシェルにテープを押し付けます。テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。
さらなる発達のために窓付きの卵をインキュベーターに戻します。これらの卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能をオフにしてください。解剖顕微鏡を使用して、胚が適切な発生段階にあることを確認し、羊膜膜および脈絡膜の位置を特定する。
次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、膜から延びる前肢の真上の羊膜膜の穴を切り、前肢を頭部の上にある膜に覆う。2対の微細な滅菌鉗子を使用し、羊膜絨毛膜ACMと絨毛膜との間の2つの隣接する位置で羊膜を優しくつかむ。羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に背方向に動かし、もう1つのペアを腹側に移動します。
滅菌された細かい鉗子を使用して、胚を覆っている残りの羊膜を解剖して除去します。滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋領域の中央付近の羊膜をつかみ、胚に対して羊膜をコドル方向に慎重に引っ張り、以前の変位した絨毛膜に向かってください。原稿に記載されているように透明なテープを使用して窓の穴を再シールし、卵をインキュベーターに戻してさらに開発します。
余分な胚膜は、右目がアクセス可能であることを保証するために再配置する必要があるかもしれません。卵中の胚の位置のために右目が創傷のためにアクセスできない場合、それは非創傷対照として役立つことができる。マイクロ解剖ナイフを使用して、脈絡膜組織に平行でインラインである右目の角膜の範囲にまたがる切開を行います。
マイクロ解剖ナイフを再度使用し、最初の切開と同じ場所で角膜を裂傷し、角膜内の同じ位置に伴って生じる2つと3つを切断するように2回以上切断する。生存率を助けるために、湾曲した虹彩鉗子を使用して、手術後に胚を絨毛膜の下に戻し、絨毛膜の適切な成長を促進する。次に、抗生物質を含むリンガー溶液を3〜4滴加えて胚を水和させ、卵子を殺菌する。
透明なテープで窓の穴を再シールし、卵を水平のままインキュベーターに戻します。胚が発達し、角膜創傷が所望の期間治癒するのを許す。孵卵後、胚を安楽死させ、湾曲した虹彩鉗子を使用して、目と顔の組織が出会う後側の目を優しくつかみ、慎重に目全体を持ち上げて顔組織から解放することによって、リンゲルの生理食塩水溶液のペトリ皿で目を収穫します。
細かい鉗子を使って目の後ろに3〜5センチの小さな穴をあけ、軽度の興奮で一晩中4°Cの4%パラホルムアルデヒドで目全体を固定します。理想的な創傷を達成するためには、鋭利なマイクロ解剖ナイフを使用し、裂傷中に正しい量の圧力を加えることが重要です。圧力が少なすぎると、前間質に十分に浸透せずに角膜上皮を引き裂く浅い創傷が生じる。
あまりにも多くの圧力を加えると、全範囲の創傷が間質全体を貫通し、房水を外部環境に曝す。適切な裂傷切開を行うことで、創傷後最初に0〜3日拡大する理想的な創傷が生じる。その後、再上皮化および新しい組織形成が起こり、最終的に創傷後11日間、瘢痕のない様式で創傷を閉鎖する。
治癒創傷内の細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチンおよびテナスシンの時空間局在は、角膜再上皮化に対応する時点で上昇することが見出され、創傷閉鎖、上皮細胞遊走および生存へのそれらの関与を示唆する。ホールマウント免疫組織化学は、創傷した中枢角膜を直接並置した神経が治癒角膜組織から一時的に阻害されることを明らかにした。以前の阻害にもかかわらず、角膜神経は最終的に、創傷後11日目に完全に治癒した角膜組織を同様の密度レベルに、そして同様のパターンで、18日目に一致した非創傷対照のステージに神経支配する。
第2世代の高調波画像法によって証明されるように、中央角膜創傷の様々な深さにわたってコラーゲン線維の束が直交して配置され、非創傷中央角膜組織の天然マクロ構造と一致する。組織移植やビーズ移植などの古典的な発生生物学アプローチ、およびレトロウイルス感染やDNAエレクトロポレーションなどの遺伝子操作のための現代のアプローチと組み合わせると、この動物モデルは、瘢痕のない角膜創傷治癒を促進するために必要な分子因子および細胞メカニズムを明らかにすることを約束します。胎児の瘢痕のない創傷治癒を調節するマトリックスタンパク質の主要な分子因子を決定することは、より少ない瘢痕化および正常な組織構造のより良い反復でより回復的な治癒プロセスを促進する治療法への道を開くであろう。
