Danos no estroma córnea adulto levam a uma resposta rápida de cicatrização de feridas que compromete a visão devido à formação opaca de tecido cicatricial. Este protocolo gera feridas em córneas de filhotes embrionários que, ao contrário dos adultos, podem curar sem cicatrizes. Dada a capacidade intrínseca da córnea embrionária ferida para se submeter a uma recapitulação completa da estrutura corneal nativa sem cicatrizes detectáveis, o filhote embrionário serve um importante modelo animal para elucidar os fatores moleculares e celulares para cicatrização de feridas córneas.
O aspecto mais desafiador desta técnica é gerar uma ferida consistente que penetra tanto o epitélio mais externo quanto o estroma córnea mais profundo. Como se está aprendendo, pode ser útil ver as córneas feridas em uma seção transversal para que a profundidade da penetração da ferida no estroma córnea possa ser avaliada. Para começar, organize os ovos horizontalmente em uma bandeja e marque-os na parte superior do ovo para indicar a posição esperada do embrião.
Incubar esses ovos em uma incubadora umidificada de 38 graus Celsius com a função de balanço ativada. Remova o ovo da incubadora no terceiro dia de desenvolvimento embrionário e posicione-o horizontalmente em um suporte de ovo seguro. Crie um pequeno orifício no topo da casca de ovo perto da extremidade pontiaguda do ovo usando a ponta afiada da tesoura dissecando.
Insira uma agulha hipodérmica de calibre 18 através do orifício. Com a agulha empurrada para o fundo da superfície interna do ovo e o lado bevel da agulha voltado para a extremidade pontiaguda do ovo, remova dois a três mililitros da albumina do ovo de galinha e descarte. Limpe a superfície da casca de ovo ao redor do orifício com lenços de fiapos, levemente umedecido com 70% de etanol e limpe.
Sele o orifício feito para remover albumina com fita clara. Com a ponta afiada da tesoura dissecando, faça um segundo buraco na parte superior da casca de ovo. Certifique-se de que a tesoura não se estenda muito até a casca do ovo para evitar o contato e danificar o embrião ou vasculatura embrionária posicionado diretamente abaixo do lado do segundo orifício.
Usando fórceps curvas, amplie o orifício da janela para se estender por aproximadamente dois a três centímetros de diâmetro para revelar e obter acesso ao embrião em desenvolvimento sob a concha. Agora, insira uma extremidade dos fórceps no buraco, mantendo-a paralela e justaposta com a casca de ovo. Com a outra extremidade fórceps posicionada fora da casca de ovo, belisque cuidadosamente as duas extremidades fórceps juntas, permitindo que eles quebrem e removam pequenos pedaços da casca de ovo.
Continue quebrando e removendo fragmentos de casca de ovo até que ainda haja uma janela de dois a três centímetros que sobrepõe diretamente o embrião. Para limitar a contaminação bacteriana, adicione 100 a 200 microliters de solução de ringer contendo 50 unidades por mililitro de penicilina e 50 microgramas por mililitro de estreptomicina através do orifício da janela. Sele o orifício da janela usando fita adesiva clara.
Realize esta vedação de ovo alinhando um canto da fita no longo eixo do orifício e pressionando a fita para a casca de um a dois centímetros de distância da borda do orifício. Continue selando ao redor da abertura até que uma aba de fita pendurada seja deixada de um lado. Pressione as duas peças de fita juntas, criando uma forma de domed sobre o orifício e pressione a aba da fita pendente na casca para terminar de selar o ovo.
Devolva os ovos com janelas à incubadora para maior desenvolvimento. Certifique-se de manter esses ovos horizontais e desligue a função de balanço das incubadoras. Use um microscópio de dissecação para garantir que o embrião esteja no estágio de desenvolvimento adequado e localize as posições da membrana amicooquionônica e da membrana corioallantóica.
Em seguida, use uma tesoura de micro dissecação esterilizada para cortar um orifício na membrana amniocônica diretamente acima do membro dianteiro que se estende da membrana, sobredindo o membro dianteiro à membrana sobredistando a cabeça. Use dois pares de fórceps finos e estéreis e pegue suavemente o amnion em duas posições adjacentes entre a membrana amicooquionica ACM e a membrana corioallantóica. Mova cuidadosamente cada par de fórceps, ambos firmemente segurando a membrana amniótica, longe um do outro com um par movendo-se dorsalmente para o embrião e o outro ventrally.
Use fórceps finos esterilizados para dissecar e remover qualquer membrana de amnion restante que cubra o embrião. Usando fórceps esterilizados, segure o amnion perto da região craniana média do embrião e puxe cuidadosamente o amnão em uma direção de coddle em relação ao embrião em direção à membrana corioallantóica deslocada anteriormente. Resseque o orifício da janela usando fita clara como descrito no manuscrito e devolva o ovo à incubadora para maior desenvolvimento.
As membranas embrionárias extras podem precisar ser reposicionadas para garantir que o olho direito esteja acessível. Se o olho direito não estiver acessível para ferimentos devido à posição do embrião no ovo, ele pode servir como um controle não ferido. Use uma faca de micro dissecação para fazer uma incisão que abrange a extensão da córnea do olho direito que é paralela e em linha com o tecido coroide.
Use a faca de micro dissecação para novamente, lacerando a córnea no mesmo local da primeira incisão, duas vezes mais de tal forma que o corte dois e corte três ocorrendo junto com a mesma posição na córnea como um corte. Para ajudar com a viabilidade, use as fórceps de íris curvas para colocar o embrião de volta sob a membrana corioallantónica após a cirurgia para promover o crescimento adequado da membrana corioallantóica. Em seguida, adicione três a quatro gotas de solução de ringer contendo antibióticos para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
Recaça o orifício da janela com fita adesiva e retorne à incubadora, deixando o ovo horizontal. Permita que o embrião se desenvolva e a ferida córnea se cure por um período desejado. Após a incubação, eutanize o embrião e use fórceps de íris curvados para colher o olho em uma placa de Petri da solução salina de Ringer, agarrando suavemente o olho em seu lado posterior onde o olho e o tecido facial se encontram e cuidadosamente levantando todo o olho para longe e livre do tecido facial.
Use fórceps finos para furar um pequeno buraco de três a cinco centímetros na parte de trás do olho inteiro e fixar todo o olho em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius durante a noite com leve agitação. Para alcançar uma ferida ideal, é crucial usar uma faca de micro dissecção afiada e aplicar a quantidade correta de pressão durante a laceração. Aplicar pouca pressão resultará em uma ferida rasa que rasga o epitélio córnea sem penetrar suficientemente o estroma anterior.
Aplicar muita pressão resulta em uma ferida de extensão total penetrando todo o estroma e expondo o humor aquoso ao ambiente externo. A realização das incisões laceradoras adequadas produz uma ferida ideal que inicialmente aumenta de zero a três dias após o ferimento. Depois disso, a ree epitelialização e a nova formação tecidual ocorrem para, em última instância, fechar a ferida de forma livre de cicatrizes por 11 dias, após o ferimento.
A localização espessora das proteínas da matriz extracelular, fibronectina e tenascina dentro da ferida cicatrizante foi encontrada elevada em pontos de tempo correspondentes à re-epitelialização da córnea, sugerindo seu envolvimento no fechamento da ferida, migração de células epiteliais e sobrevivência. A imunohistoquímica do monte inteiro revelou que os nervos que justtaposed diretamente a córnea central ferida são temporariamente inibidos do tecido córnea curativo. Apesar da inibição anterior, os nervos da córnea eventualmente inervam o tecido córnea totalmente curado 11 dias após a ferida a níveis de densidade semelhantes e em padrões semelhantes aos controles não feridos combinados no dia 18.
Como evidenciado pela imagem harmônica de segunda geração, feixes de fibras de colágeno em diferentes profundidades da ferida central da córnea são vistos organizados ortogonalmente, combinando com a estrutura macro nativa do tecido córnea central não ferido. Quando combinado com abordagens clássicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecidos e implantação de contas, bem como abordagens modernas para manipulação genética, como infecção retroviral e eletroporação de DNA, este modelo animal promete revelar fatores moleculares e mecanismos celulares necessários para promover a cicatrização da ferida da córnea. Determinar fatores moleculares fundamentais em proteínas matriciais que regulam a cicatrização de feridas sem cicatrizes fetais abrirá caminho para terapias que promovam um processo de cura mais restaurador com menos cicatrizes e melhor recapitulação da arquitetura normal do tecido.
