成人角膜基质的损伤导致快速的伤口愈合反应，由于不透明的疤痕组织形成而损害了一个人的视力。该协议在胚胎雏鸡角膜中产生伤口，与成人不同，可以愈合而没有疤痕。鉴于受伤的胚胎角膜的内在能力，可以对天然角膜结构进行完全的概括，而没有可检测到的疤痕，胚胎雏鸡是阐明无疤痕角膜伤口愈合的分子和细胞因素的重要动物模型。
该技术最具挑战性的方面是产生一致的伤口，穿透最外层的上皮和更深的角膜基质。随着人们的学习，在横截面上观察受伤的角膜可能会有所帮助，以便可以评估伤口渗透到角膜基质中的深度。首先，将卵子水平排列在托盘上，并在卵子的顶部标记它们以表示胚胎的预期位置。
将这些蛋在38摄氏度的加湿孵化器中孵化，并激活摇摆功能。在胚胎发育的第三天将卵从培养箱中取出，并将其水平放置在安全的卵架中。使用解剖剪刀的尖锐端在靠近鸡蛋尖端的蛋壳顶部创建一个小孔。
将 18 号斜角皮下注射针插入孔中。将针头推到鸡蛋内表面的底部，针的斜面朝向鸡蛋的尖头，从鸡蛋中取出两到三毫升的白蛋白并丢弃。用不起毛的湿巾清洁孔周围的蛋壳表面，用70%乙醇轻轻蘸湿，擦干。
用透明胶带密封用于去除白蛋白的孔。用解剖剪刀的尖锐一端，在蛋壳的顶部做第二个窗口孔。确保剪刀不要延伸到卵壳中太远，以避免接触和损坏位于第二个孔一侧正下方的胚胎或胚胎脉管系统。
使用弯曲的镊子，将窗孔加宽，直径约两到三厘米，以显示并进入壳下发育中的胚胎。现在，将镊子的一端插入孔中，使其与蛋壳平行并紧密并置。将另一个镊子末端放在蛋壳外，小心地将两个镊子的末端捏在一起，使它们断裂并取出蛋壳的小块。
继续破碎并去除蛋壳碎片，直到留下一个两到三厘米的窗口直接覆盖胚胎。为了限制细菌污染，通过窗口孔加入100至200微升的环形溶液，其中含有每毫升青霉素50单位和每毫升链霉素50微克。使用透明胶带密封窗孔。
通过将胶带的一角对准孔的长轴上，然后将胶带压到距离孔边缘一到两厘米的壳上来执行此蛋封口。继续密封开口，直到一侧留下一圈悬挂的胶带。将两块胶带压在一起，在孔上形成一个圆顶形状，然后将悬垂的胶带的翻盖压到壳上以完成密封鸡蛋。
将窗口卵放回孵化器进行进一步发育。确保使这些蛋保持水平并关闭孵化器摇动功能。使用解剖显微镜确保胚胎处于适当的发育阶段，并定位羊膜和绒毛膜骨腔骨膜的位置。
然后使用灭菌的微解剖剪刀在从膜延伸的前肢正上方的羊膜上切一个孔，从前肢上覆盖到覆盖头部的膜上。使用两对细小的无菌镊子，在羊膜ACM和绒毛膜腔内膜之间的两个相邻位置轻轻抓住羊膜。小心地移动每对镊子，两个镊子都牢牢地抓住羊膜，彼此远离，一对向胚胎背侧移动，另一对在腹侧移动。
使用灭菌的细镊子解剖并去除覆盖胚胎的任何残留的羊膜。使用灭菌的镊子，抓住胚胎中颅区附近的羊膜，并小心地将羊膜拉向相对于胚胎的coddle方向，朝向早期移位的绒毛膜。如手稿中所述，使用透明胶带重新密封窗孔，并将鸡蛋放回孵化器进行进一步发育。
额外的胚胎膜可能需要重新定位，以确保右眼是可接近的。如果由于胚胎在卵子中的位置而无法进入右眼进行伤口，则可以用作非受伤的对照。使用显微解剖刀做一个横跨右眼角膜范围的切口，该切口与脉络膜组织平行并内联。
再次使用显微解剖刀，在与第一切口相同的位置撕裂角膜，两倍以上，这样切割两个和切割三个角膜的位置与切割角膜的位置相同。为了帮助提高生存能力，手术后使用弯曲的虹膜镊子将胚胎塞回绒毛膜下，以促进绒毛膜的正常生长。接下来，加入三到四滴含有抗生素的铃声溶液，以滋润胚胎并对卵子进行灭菌。
用透明胶带重新密封窗孔，然后返回培养箱，使鸡蛋保持水平。让胚胎发育，角膜伤口愈合一段所需的时间。孵育后，对胚胎实施安乐死，并使用弯曲的虹膜镊子在林格盐水溶液的培养皿中收获眼睛，方法是轻轻抓住眼睛和面部组织相遇的后侧的眼睛，并小心地将整个眼睛抬开并从面部组织中解放出来。
用细镊子在整个眼睛的后部戳一个三到五厘米的小孔，并将整个眼睛固定在4%的多聚甲醛中，在四摄氏度下轻轻搅拌过夜。为了获得理想的伤口，使用锋利的微切割刀并在撕裂过程中施加正确的压力至关重要。施加太轻的压力会导致浅伤口撕裂角膜上皮，而不会充分穿透前基质。
施加过多的压力会导致伤口完全穿透整个基质，并将房水暴露在外部环境中。进行适当的撕裂切口会产生理想的伤口，最初在受伤后0至3天扩大。之后，发生上皮再生和新组织形成，最终在伤口后11天内以无疤痕的方式闭合伤口。
发现愈合伤口内细胞外基质蛋白，纤连蛋白和替那辛的时空定位在与角膜再上皮化相对应的时间点升高，表明它们参与伤口闭合，上皮细胞迁移和存活。全山免疫组化表明，直接并列受伤的中央角膜的神经暂时受到角膜组织愈合的抑制。尽管早期受到抑制，但角膜神经最终在伤口后11天将完全愈合的角膜组织支配到相似的密度水平，并且以与第18天匹配的未受伤对照的阶段相似的模式。
正如第二代谐波成像所证明的那样，在中心角膜伤口的不同深度处看到的胶原纤维束正交排列，与非受伤的中心角膜组织的天然宏观结构相匹配。当与经典的发育生物学方法（如组织移植和珠子植入）以及现代基因操作方法（如逆转录病毒感染和DNA电穿孔）相结合时，该动物模型有望揭示促进无疤痕角膜伤口愈合所需的分子因素和细胞机制。确定基质蛋白中调节胎儿无疤痕伤口愈合的关键分子因子将为促进更多恢复性愈合过程的疗法铺平道路，从而减少疤痕并更好地概括正常组织结构。
