Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés

Les dommages au stroma cornéen adulte entraînent une réponse rapide à la cicatrisation des plaies qui compromet la vision en raison de la formation de tissu cicatriciel opaque. Ce protocole génère des plaies dans les cornées embryonnaires de poussins qui, contrairement aux adultes, peuvent guérir sans cicatrice. Compte tenu de la capacité intrinsèque de la cornée embryonnaire blessée à subir une récapitulation complète de la structure cornéenne native sans cicatrice détectable, le poussin embryonnaire sert de modèle animal important pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires pour la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.

L’aspect le plus difficile de cette technique est de générer une plaie cohérente qui pénètre à la fois dans l’épithélium le plus externe et dans le stroma cornéen plus profond. Au fur et à mesure que l’on apprend, il peut être utile de voir les cornées blessées en coupe transversale afin que la profondeur de la pénétration de la plaie dans le stroma cornéen puisse être évaluée. Pour commencer, disposez les œufs horizontalement sur un plateau et marquez-les en haut de l’œuf pour indiquer la position attendue de l’embryon.

Incuber ces œufs dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius avec la fonction de bascule activée. Retirez l’œuf de l’incubateur le troisième jour du développement embryonnaire et positionnez-le horizontalement dans un porte-œufs sécurisé. Créez un petit trou dans le haut de la coquille de l’œuf près de l’extrémité pointue de l’œuf à l’aide de l’extrémité tranchante des ciseaux disséquants.

Insérez une aiguille hypodermique biseautée de calibre 18 à travers le trou. Avec l’aiguille poussée au fond de la surface interne de l’œuf et le côté biseauté de l’aiguille face à l’extrémité pointue de l’œuf, retirez deux à trois millilitres de l’albumine de l’œuf de poule et jetez-le. Nettoyez la surface de la coquille d’œuf entourant le trou avec des lingettes non pelucheuses, légèrement humidifiées avec de l’éthanol à 70% et essuyez-les.

Scellez le trou fait pour enlever l’albumine avec du ruban adhésif transparent. Avec l’extrémité tranchante des ciseaux disséqués, faites un deuxième trou de fenêtre dans le haut de la coquille d’œuf. Assurez-vous que les ciseaux ne s’étendent pas trop loin dans la coquille de l’œuf pour éviter de contacter et d’endommager l’embryon ou le système vasculaire embryonnaire positionné directement sous le côté du deuxième trou.

À l’aide de pinces incurvées, élargissez le trou de la fenêtre pour qu’il s’étende sur environ deux à trois centimètres de diamètre afin de révéler et d’accéder à l’embryon en développement sous la coquille. Maintenant, insérez une extrémité de la pince dans le trou, en la gardant parallèle et étroitement juxtaposée à la coquille d’œuf. Avec l’autre extrémité de la pince positionnée à l’extérieur de la coquille d’œuf, pincez soigneusement les deux extrémités de la pince ensemble, ce qui leur permet de se briser et d’enlever de petits morceaux de la coquille d’œuf.

Continuez à casser et à retirer les fragments de coquille d’œuf jusqu’à ce qu’il reste une fenêtre de deux à trois centimètres qui recouvre directement l’embryon. Pour limiter la contamination bactérienne, ajouter 100 à 200 microlitres de solution de sonnerie contenant 50 unités par millilitre de pénicilline et 50 microgrammes par millilitre de streptomycine à travers le trou de la fenêtre. Scellez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent.

Effectuez ce scellement d’œuf en alignant un coin du ruban sur le long axe du trou et en appuyant le ruban sur la coquille à un à deux centimètres du bord du trou. Continuez à sceller autour de l’ouverture jusqu’à ce qu’un rabat de ruban adhésif suspendu soit laissé d’un côté. Pressez les deux morceaux de ruban adhésif ensemble, créant une forme de dôme sur le trou et appuyez sur le rabat de ruban adhésif en surplomb sur la coquille pour finir de sceller l’œuf.

Retournez les œufs fenêtrés à l’incubateur pour un développement ultérieur. Assurez-vous de garder ces œufs horizontaux et éteignez la fonction de bascule des incubateurs. Utilisez un microscope à dissection pour vous assurer que l’embryon est au bon stade de développement et localiser les positions de la membrane amniochorionique et de la membrane chorioallantoïque.

Ensuite, utilisez des ciseaux à micro-dissection stérilisés pour percer un trou dans la membrane amniochorionique directement au-dessus du membre antérieur qui s’étend de la membrane, recouvrant le membre antérieur à la membrane recouvrant la tête. Utilisez deux paires de pinces stériles fines et saisissez doucement l’amnion dans deux positions adjacentes entre la membrane amniochorionique ACM et la membrane chorioallantoïque. Déplacez soigneusement chaque paire de pinces, les deux saisissant fermement la membrane amniotique, l’une loin de l’autre, l’une se déplaçant dorsalement vers l’embryon et l’autre ventralement.

Utilisez des pinces fines stérilisées pour disséquer et retirer toute membrane d’amnion restante recouvrant l’embryon. À l’aide d’une pince stérilisée, saisissez l’amnion près de la région crânienne moyenne de l’embryon et tirez soigneusement l’amnion dans une direction de dorlotage par rapport à l’embryon vers la membrane chorioallantoïque déplacée plus tôt. Refermez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent comme décrit dans le manuscrit et retournez l’œuf à l’incubateur pour un développement ultérieur.

Les membranes embryonnaires supplémentaires peuvent devoir être repositionnées pour s’assurer que l’œil droit est accessible. Si l’œil droit n’est pas accessible pour la blessure en raison de la position de l’embryon dans l’ovule, il peut servir de contrôle non blessé. Utilisez un couteau à micro disséquer pour faire une incision qui couvre l’étendue de la cornée de l’œil droit qui est parallèle et alignée avec le tissu choroïde.

Utilisez le couteau à micro disséquer pour lacérer à nouveau la cornée au même endroit que la première incision, deux fois plus de manière à ce que la coupe deux et la coupe trois se produisent avec la même position dans la cornée que la coupe une. Pour aider à la viabilité, utilisez la pince à iris incurvée pour replacer l’embryon sous la membrane chorioallantoïque après la chirurgie afin de favoriser une bonne croissance de la membrane chorioallantoïque. Ensuite, ajoutez trois à quatre gouttes de solution de sonnerie contenant des antibiotiques pour hydrater l’embryon et stériliser l’œuf.

Refermez le trou de la fenêtre avec du ruban adhésif transparent et retournez à l’incubateur, en laissant l’œuf à l’horizontale. Laissez l’embryon se développer et la plaie cornéenne guérir pendant la période souhaitée. Après l’incubation, euthanasez l’embryon et utilisez une pince à iris incurvée pour prélever l’œil dans une boîte de Petri de la solution saline de Ringer en saisissant doucement l’œil sur sa face postérieure où l’œil et le tissu facial se rencontrent et en soulevant soigneusement tout l’œil loin et libre du tissu facial.

Utilisez une pince fine pour percer un petit trou de trois à cinq centimètres à l’arrière de l’œil entier et fixez tout l’œil dans du paraformaldéhyde à 4% à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec une légère agitation. Pour obtenir une plaie idéale, il est crucial d’utiliser un couteau à micro-dissection tranchant et d’appliquer la bonne quantité de pression pendant la lacération. Appliquer trop peu de pression entraînera une plaie superficielle qui déchire l’épithélium cornéen sans pénétrer suffisamment le stroma antérieur.

L’application d’une trop grande pression entraîne une plaie complète pénétrant dans tout le stroma et exposant l’humeur aqueuse à l’environnement extérieur. La réalisation des incisions lacérées appropriées produit une plaie idéale qui grossit initialement de zéro à trois jours après la blessure. Après cela, une ré-épithélialisation et la formation de nouveaux tissus se produisent pour finalement fermer la plaie sans cicatrice de 11 jours, après la blessure.

La localisation spatio-temporelle des protéines de la matrice extracellulaire, de la fibronectine et de la ténascine dans la plaie cicatrisante s’est avérée élevée aux points temporels correspondant à la réépithélialisation de la cornée, ce qui suggère leur implication dans la fermeture de la plaie, la migration des cellules épithéliales et la survie. L’immunohistochimie de la monture entière a révélé que les nerfs qui juxtaposaient directement la cornée centrale blessée sont temporairement inhibés du tissu cornéen cicatrisant. Malgré une inhibition antérieure, les nerfs cornéens finissent par innerver le tissu cornéen complètement guéri 11 jours après la blessure à des niveaux de densité similaires et selon des schémas similaires à ceux des témoins non blessés au stade correspondant au jour embryonnaire 18.

Comme en témoigne l’imagerie harmonique de deuxième génération, des faisceaux de fibres de collagène à différentes profondeurs de la plaie cornéenne centrale sont disposés orthogonalement, correspondant à la macrostructure native du tissu cornéen central non blessé. Lorsqu’il est combiné avec des approches classiques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus et l’implantation de billes, ainsi qu’avec des approches modernes de manipulation génique telles que l’infection rétrovirale et l’électroporation de l’ADN, ce modèle animal promet de révéler les facteurs moléculaires et les mécanismes cellulaires nécessaires pour favoriser la cicatrisation sans cicatrice des plaies cornéennes. La détermination des facteurs moléculaires clés dans les protéines matricielles qui régulent la cicatrisation des plaies fœtales sans cicatrice ouvrira la voie à des thérapies qui favorisent un processus de guérison plus réparateur avec moins de cicatrices et une meilleure récapitulation de l’architecture tissulaire normale.