يوفر هذا البروتوكول طريقة جديدة للتحقيق في فتح التوصيل المنخفض لمسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة سهلة لقياس الاحتمال المفتوح للمسام كدالة لإمكانات غشاء الميتوكوندريا. يمكن تطبيق هذه التقنية بسهولة على الميتوكوندريا المعزولة من أي نظام عضوي وأنواع.
ابدأ بمعايرة قطب الأكسجين عن طريق وضع قطرة من محلول إلكتروليت كلوريد البوتاسيوم بنسبة 50٪ فوق قبة قرص القطب الكهربائي. ضع قطعة صغيرة من فواصل ورق السجائر بسنتيمترين مربعين مغطاة بقطعة أكبر قليلا من غشاء البولي تترافلورو إيثيلين فوق قطرة المنحل بالكهرباء. ثم استخدم أداة قضيب لدفع قرص القطب الصغير O-ring فوق قبة القطب الكهربائي.
بعد ذلك ، قم بتعبئة الخزان جيدا بمحلول المنحل بالكهرباء. ضع الحلقة O الأكبر في العطلة حول قرص القطب الكهربائي جيدا. ثم قم بتثبيت القرص في غرفة القطب الكهربائي ، وقم بتوصيله بوحدة التحكم.
أضف ملليلترين من الماء منزوع الأيونات المشبع بالهواء ، والمغناطيس المطلي بالبولي تترافلورو إيثيلين إلى غرفة التفاعل. عند الانتهاء ، قم بتوصيل الغرفة بالجزء الخلفي من وحدة التحكم. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، وسرعة التحريك على 100.
اسمح لدرجة حرارة النظام بالتوازن لمدة 10 دقائق قبل المعايرة. بعد التأكد من درجة الحرارة الصحيحة وسرعة التحريك والضغط، ضمن علامة التبويب معايرة، حدد خيار معايرة الطور السائل لإجراء معايرة الطور السائل. ثم اضغط على موافق، وانتظر حتى تستقر الإشارة.
بمجرد الوصول إلى الهضبة، اضغط على موافق. ثم أضف حوالي 20 ملليغرام من ثنائي ثيونيت الصوديوم لإنشاء صفر أكسجين في الغرفة. مرة أخرى، اضغط على موافق، وانتظر حتى تستقر الإشارة قبل النقر فوق الزر حفظ لقبول المعايرة. لإعداد رباعي فينيل فوسفونيوم ، أو مجموعة القطب الانتقائي TPP ، املأ طرف القطب الانتقائي TPP بمحلول TPP TPP 10 ملليمولار باستخدام حقنة وإبرة مرنة.
تجنب فقاعات الهواء أثناء ملء طرف القطب الكهربائي. قم بفك غطاء حامل القطب الكهربائي لإدخال القطب المرجعي الداخلي في طرف TPP. عند الانتهاء من ذلك ، قم بتجميع جهاز القطب الكهربائي الانتقائي TPP ، بما في ذلك القطب المرجعي وحامل القطب الكهربائي.
شد الغطاء لتأمين الطرف. ثم قم بتوصيل الكابل بالمنفذ الإضافي لصندوق التحكم ، وحامل القطب الكهربائي TPP. أدخل الأقطاب الكهربائية الانتقائية والمرجعية TPP في مجموعة المكبس المكيفة للأقطاب الكهربائية الانتقائية الأيونية.
قم بتوصيل القطب المرجعي بالمنفذ المرجعي لمربع التحكم. بعد ذلك ، لإعداد غرفة التفاعل ، أضف ملليلتر واحد من خليط التفاعل إلى غرفة التفاعل دون إنشاء فقاعات هواء. أغلق الغرفة باستخدام مجموعة المكبس المكيفة مع الأقطاب الكهربائية الانتقائية والمرجعية TPP في مكانها.
بمجرد إغلاق الغرفة ، أدخل كواشف إضافية مباشرة إلى غرفة التفاعل باستخدام محاقن دقيقة منفصلة معدلة بأنابيب بلاستيكية. عندما يكون الإعداد جاهزا، حدد انتقال لبدء التسجيل. بمجرد الحصول على إشارة جهد مستقرة، قم بمعايرة القطب الانتقائي TPP عن طريق إضافة زيادات ميكرومولية واحدة من محلول TPP 0.1 ملليمولار لتحقيق تركيز نهائي من ثلاثة ميكرومولار.
لاحظ الانخفاض اللوغاريتمي في إشارة الجهد TPP مع كل إضافة. بعد تثبيت آثار الأكسجين و TPP ، أضف 100 ميكروغرام من الميتوكوندريا القلبية العضلية الطازجة إلى غرفة التفاعل عبر منفذ إضافة الكاشف في مجموعة المكبس إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. لاحظ الانخفاض في مستويات الأكسجين في الغرفة حيث تصبح الميتوكوندريا نشطة وتستهلك الأكسجين.
أيضا ، انظر الزيادة المفاجئة في إشارة الجهد TPP حيث تولد الميتوكوندريا إمكانات غشائية وتأخذ TPP من المحلول. ثم أضف 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر أوليغوميسين للحث على التنفس في الحالة 4. لتقييم الاحتمال المفتوح لمسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا ، أو mPTP ، لاحظ الانخفاض في إمكانات الغشاء بمرور الوقت أثناء التنفس التسربي.
بمجرد الوصول إلى إمكانات الغشاء المطلوبة ، أضف سيكلوسبورين ميكرومولار A كمثبط mPTP إلى غرفة التفاعل لتقييم الاحتمال المفتوح ل mPTP عند إمكانات الغشاء المحددة هذه. ثم قم بقياس تأثير السيكلوسبورين A على استهلاك الأكسجين وإمكانات الغشاء قبل وبعد إضافة السيكلوسبورين A. في المنحنيات التمثيلية لاستهلاك الأكسجين المتزامن وإمكانات الغشاء ، تم تعيين إمكانات الغشاء العالية عند الصفر ، والوسيطة عند خمسة ، ومنخفضة عند 10 مللي فولت بالنسبة إلى مستويين من معايرة TPP الميكرومولية.
أظهرت الميتوكوندريا عند صفر مللي فولت احتمالا مغلقا بنسبة 100٪ mPTP ، وعند 10 مللي فولت أظهرت احتمالا مفتوحا بنسبة 100٪. بعد إضافة oligomycin ، لم يلاحظ اختلاف كبير في استهلاك الأكسجين ، مما يشير إلى أن الأدينوسين ثلاثي الفوسفات ، أو ATP synthase ، يساهم في الحد الأدنى من التنفس في الحالة 2. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة معدل استهلاك الأكسجين وإمكانات الغشاء قبل وبعد إضافة السيكلوسبورين A.
يشير انخفاض معدل استهلاك الأكسجين وزيادة في استقرار إمكانات الغشاء إلى إغلاق mPTP مفتوح. عندما يتم إغلاق mPTP ، لم يكن هناك انخفاض في معدل استهلاك الأكسجين ، واستمرت إمكانات الغشاء في الانخفاض. أظهرت النتائج احتمالات mPTP مغلقة ومفتوحة مماثلة في إمكانات غشاء عالية ومنخفضة في التحكم FVB والميتوكوندريا القلبية بالضربة القاضية Fmr1.
في إمكانات الغشاء المتوسط ، أظهرت الميتوكوندريا القلبية Fmr1 بالضربة القاضية زيادة في احتمال mPTP المغلق مقارنة بعناصر التحكم FVB. يجب عدم إدخال فقاعات الهواء إلى الغرفة ، لأن هذا سيؤدي إلى قراءات غير مستقرة لاستهلاك الأكسجين ، ويجعل التفسير صعبا. بعد هذا الإجراء ، يمكن قياس قدرة تحميل الكالسيوم.
تقوم هذه الطريقة بتقييم فتحة التوصيل العالي للمسام ، وتكمل نتائج تقنيتنا.
