이 프로토콜은 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 낮은 전도도 개방을 조사하는 새로운 방법을 제공한다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 막 전위의 함수로서 기공의 개방 확률을 측정하는 쉬운 방법을 제공한다는 것이다. 이 기술은 모든 장기 시스템 및 종으로부터 분리된 미토콘드리아에 쉽게 적용될 수 있다.
전극 디스크의 돔 위에 50 % 염화칼륨 전해질 용액의 방울을 배치하여 산소 전극의 교정으로 시작하십시오. 전해질 방울 위에 약간 더 큰 폴리테트라플루오로에틸렌 막으로 덮인 두 평방 센티미터의 담배 종이 스페이서의 작은 조각을 놓는다. 그런 다음 어플리케이터 도구를 사용하여 작은 전극 디스크 O 링을 전극의 돔 위로 밀어 넣습니다.
다음으로, 전해질 용액으로 저장소를 잘 충전하십시오. 더 큰 O-링을 전극 디스크 주위의 오목부에 잘 놓습니다. 그런 다음 디스크를 전극 챔버에 설치하고 제어 장치에 연결하십시오.
두 밀리리터의 공기 포화 탈이온수를 첨가하고, 폴리테트라플루오로에틸렌-코팅된 자석을 반응 챔버에 첨가한다. 완료되면 챔버를 제어 장치의 후면에 연결하십시오. 온도를 섭씨 37도로 설정하고 교반 속도를 100으로 설정하십시오.
교정 전에 시스템 온도가 10분 동안 평형을 이루도록 하십시오. 올바른 온도, 교반 속도 및 압력을 보장한 후 교정 탭에서 액상 교정 옵션을 선택하여 액상 교정을 수행합니다. 그런 다음 OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다립니다.
고원에 도달하면 OK를 누릅니다. 그런 다음 약 20 밀리그램의 나트륨 디티오나이트를 첨가하여 챔버에 제로 산소를 만듭니다. 다시 OK를 누르고 신호가 고원이 될 때까지 기다렸다가 저장 버튼을 클릭하여 보정을 수락합니다. 테트라페닐포스포늄 또는 TPP 선택성 전극 어셈블리를 제조하기 위해, TPP 선택성 전극 팁을 주사기 및 가요성 바늘을 사용하여 10 밀리몰 TPP 용액으로 채운다.
전극 팁을 채우는 동안 기포를 피하십시오. 전극 홀더 캡을 느슨하게 하여 내부 기준 전극을 TPP 팁에 삽입합니다. 완료되면, 기준 전극 및 전극 홀더를 포함하는 TPP 선택성 전극 장치를 조립한다.
뚜껑을 조여서 팁을 고정시킵니다. 그런 다음 케이블을 컨트롤 박스의 보조 포트와 TPP 전극 홀더에 연결하십시오. TPP 선택 및 기준 전극을 이온 선택성 전극을 위한 적응된 플런저 어셈블리에 삽입합니다.
컨트롤 박스의 기준 포트에 참조 전극을 연결합니다. 다음으로, 반응 챔버를 제조하기 위해, 기포를 생성하지 않고 반응 혼합물 한 밀리리터를 반응 챔버에 첨가한다. TPP 선택성 및 기준 전극을 제자리에 두고 적응된 플런저 어셈블리를 사용하여 챔버를 닫는다.
챔버가 닫히면 플라스틱 튜브로 개질된 별도의 마이크로 주사기를 사용하여 추가 시약을 반응 챔버에 직접 도입합니다. 설정이 준비되면 이동을 선택하여 녹화를 시작합니다. 일단 안정한 전압 신호가 얻어지면, 세 마이크로몰의 최종 농도를 달성하기 위해 0.1 밀리몰 TPP 용액의 1 마이크로몰 증분을 첨가함으로써 TPP 선택적 전극을 교정한다.
TPP 전압 신호의 로그 감소를 관찰할 때마다 이를 관찰한다. 산소 및 TPP 트레이스를 안정화시킨 후, 플런저 어셈블리의 시약 첨가 포트를 통해 갓 준비된 심근세포 미토콘드리아를 밀리리터당 0.1밀리그램의 최종 농도로 반응 챔버에 100 마이크로그램을 첨가한다. 미토콘드리아가 활력을 얻고 산소를 소비함에 따라 챔버의 산소 수준이 감소하는 것을 관찰하십시오.
또한, 미토콘드리아가 막 전위를 생성하고 용액으로부터 TPP를 흡수함에 따라 TPP 전압 신호의 급격한 증가를 참조하십시오. 그런 다음 밀리리터 당 2.5 마이크로 그램의 올리고 마이신을 첨가하여 상태 4 호흡을 유도하십시오. 미토콘드리아 투과성 전이 기공 또는 mPTP의 개방 확률을 평가하기 위해, 누출 호흡 동안 시간에 따른 막 전위의 감소를 관찰한다.
원하는 막 전위에 도달하면, mPTP 억제제로서 하나의 마이크로몰 사이클로스포린 A를 반응 챔버에 첨가하여 그 특정 막 전위에서 mPTP의 개방 확률을 평가한다. 그런 다음 사이클로스포린 A 첨가 전후의 산소 소비 및 막 전위에 대한 사이클로스포린 A의 효과를 측정한다. 동시 산소 소비 및 막 전위의 대표적인 곡선에서, 높은 막 전위는 두 마이크로몰 TPP 교정 수준에 비해 0, 중간에서 5, 그리고 10 밀리볼트에서 낮게 설정되었다.
제로 밀리볼트의 미토콘드리아는 100%mPTP 폐쇄 확률을 나타내었고, 10밀리볼트에서는 100%개방 확률을 나타내었다. 올리고마이신 첨가 후, 산소 소비량의 유의한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 아데노신 트리포스페이트 또는 ATP 신타제가 상태 2 호흡에 최소한으로 기여한다는 것을 시사한다. 또한, 사이클로스포린 A 첨가 전후의 산소 소모율과 막 전위를 비교하였다.
산소 소모율의 감소와 막 전위의 안정화의 증가는 개방 mPTP의 폐쇄를 나타냈다. mPTP가 폐쇄되었을 때, 산소 소모율의 감소는 없었고, 막 전위는 계속 떨어졌다. 결과는 FVB 대조군 및 Fmr1 녹아웃 심장 미토콘드리아에서 높고 낮은 막 전위에서 유사한 폐쇄 및 개방 mPTP 확률을 입증하였다.
중간 막 전위에서, Fmr1 녹아웃 심장 미토콘드리아는 FVB 대조군에 비해 증가된 폐쇄 mPTP 확률을 입증하였다. 챔버에 기포를 도입해서는 안되며, 이는 불안정한 산소 소비 판독 값을 초래하고 해석을 어렵게 만듭니다. 이 절차에 따라 칼슘 로딩 용량을 측정 할 수 있습니다.
이 방법은 기공의 높은 전도도 개방을 평가하고 우리 기술의 결과를 보완합니다.
