Este protocolo proporciona una nueva forma de investigar la apertura de baja conductancia del poro de transición de permeabilidad mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una manera fácil de medir la probabilidad abierta del poro en función del potencial de la membrana mitocondrial. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a las mitocondrias aisladas de cualquier sistema de órganos y especies.
Comience con la calibración del electrodo de oxígeno colocando una gota de solución electrolítica de cloruro de potasio al 50% en la parte superior de la cúpula del disco del electrodo. Coloque un pequeño trozo de espaciador de papel de cigarrillo de dos centímetros cuadrados cubierto con un trozo ligeramente más grande de membrana de politetrafluoroetileno sobre la gota de electrolito. Luego use la herramienta aplicadora para empujar la pequeña junta tórica del disco del electrodo sobre la cúpula del electrodo.
A continuación, rellene bien el depósito con la solución de electrolito. Coloque la junta tórica más grande en el hueco alrededor del disco del electrodo. A continuación, instale el disco en la cámara del electrodo y conéctelo a la unidad de control.
Agregue dos mililitros de agua desionizada saturada de aire y el imán recubierto de politetrafluoroetileno a la cámara de reacción. Cuando haya terminado, conecte la cámara a la parte posterior de la unidad de control. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y la velocidad de agitación a 100.
Permita que la temperatura del sistema se equilibre durante 10 minutos antes de la calibración. Después de asegurarse de la temperatura, la velocidad de agitación y la presión correctas, en la pestaña Calibración, seleccione la opción Calibración en fase líquida para realizar la calibración en fase líquida. Luego presione OK y espere a que la señal se estabilice.
Una vez que se alcanza la meseta, presione OK. Luego agregue aproximadamente 20 miligramos de ditionita de sodio para establecer cero oxígeno en la cámara. De nuevo, pulse OK y espere a que la señal se estabilice antes de hacer clic en el botón Guardar para aceptar la calibración. Para preparar el tetrafenilfosfonio, o conjunto de electrodos selectivos de TPP, llene la punta del electrodo selectivo de TPP con una solución de TPP de 10 milimolares con una jeringa y una aguja flexible.
Evite las burbujas de aire mientras llena la punta del electrodo. Afloje la tapa del soporte del electrodo para insertar el electrodo de referencia interno en la punta TPP. Cuando haya terminado, ensamble el aparato de electrodo selectivo TPP, incluidos el electrodo de referencia y el soporte del electrodo.
Apriete la tapa para asegurar la punta. A continuación, conecte el cable al puerto auxiliar de la caja de control y al soporte del electrodo TPP. Inserte los electrodos selectivos y de referencia TPP en el conjunto del émbolo adaptado para electrodos selectivos de iones.
Conecte el electrodo de referencia al puerto de referencia de la caja de control. A continuación, para preparar la cámara de reacción, agregue un mililitro de la mezcla de reacción a la cámara de reacción sin crear burbujas de aire. Cierre la cámara utilizando el conjunto del émbolo adaptado con los electrodos selectivos y de referencia TPP en su lugar.
Una vez que la cámara esté cerrada, introduzca reactivos adicionales directamente en la cámara de reacción utilizando microhersileras separadas modificadas con tubos de plástico. Cuando la configuración esté lista, seleccione Ir para iniciar la grabación. Una vez que se obtiene una señal de voltaje estable, calibre el electrodo selectivo de TPP agregando incrementos micromolares de una solución de TPP de 0.1 milimolares para lograr una concentración final de tres micromolares.
Observe la disminución logarítmica en la señal de voltaje TPP con cada adición. Después de estabilizar los rastros de oxígeno y TPP, agregue 100 microgramos de mitocondrias de cardiomiocitos recién preparadas a la cámara de reacción a través del puerto de adición de reactivos en el conjunto del émbolo a una concentración final de 0.1 miligramos por mililitro. Observe la disminución en los niveles de oxígeno en la cámara a medida que las mitocondrias se energizan y consumen oxígeno.
Además, vea el aumento abrupto en la señal de voltaje TPP a medida que las mitocondrias generan un potencial de membrana y absorben TPP de la solución. Luego agregue 2.5 microgramos por mililitro de oligomicina para inducir la respiración de Estado 4. Para evaluar la probabilidad abierta del poro de transición de permeabilidad mitocondrial, o mPTP, observe la disminución del potencial de membrana a lo largo del tiempo durante la respiración por fuga.
Una vez que se alcanza el potencial de membrana deseado, agregue una ciclosporina A micromolar como inhibidor de mPTP a la cámara de reacción para evaluar la probabilidad abierta de mPTP en ese potencial de membrana específico. Luego mida el efecto de la ciclosporina A sobre el consumo de oxígeno y el potencial de membrana antes y después de la adición de ciclosporina A. En las curvas representativas de consumo simultáneo de oxígeno y potencial de membrana, el alto potencial de membrana se estableció en cero, intermedio en cinco y bajo en 10 milivoltios en relación con el nivel de calibración de TPP de dos micromolares.
Las mitocondrias a cero milivoltios exhibieron una probabilidad cerrada del 100% mPTP, y a 10 milivoltios exhibieron una probabilidad abierta del 100%. Después de la adición de oligomicina, no se observó una diferencia significativa en el consumo de oxígeno, lo que sugiere que el trifosfato de adenosina, o ATP sintasa, contribuye mínimamente a la respiración del Estado 2. Además, se compararon la tasa de consumo de oxígeno y el potencial de membrana antes y después de la adición de ciclosporina A.
Una disminución en la tasa de consumo de oxígeno y un aumento en la estabilización del potencial de membrana indicaron el cierre de un mPTP abierto. Cuando se cierra el mPTP, no hubo disminución en la tasa de consumo de oxígeno y el potencial de membrana continuó cayendo. Los resultados demostraron probabilidades similares de mPTP cerrada y abierta a potenciales de membrana altos y bajos en el control FVB y las mitocondrias cardíacas knockout Fmr1.
En el potencial de membrana intermedia, las mitocondrias cardíacas knockout Fmr1 demostraron una mayor probabilidad de mPTP cerrada en comparación con los controles FVB. No se deben introducir burbujas de aire en la cámara, ya que esto conducirá a lecturas de consumo de oxígeno inestables y dificultará la interpretación. Después de este procedimiento, se puede medir la capacidad de carga de calcio.
Este método evalúa la alta apertura de conductancia del poro, y complementa los resultados de nuestra técnica.
