このプロトコルは、ミトコンドリア透過性遷移細孔の低コンダクタンス開口部を調査する新しい方法を提供する。この技術の主な利点は、ミトコンドリア膜電位の関数として孔の開放確率を測定する簡単な方法を提供することである。この技術は、任意の器官系および種から単離されたミトコンドリアに容易に適用することができる。
酸素電極の校正は、電極ディスクのドームの上に50%塩化カリウム電解質溶液を滴下して開始します。電解質滴の上に、わずかに大きいポリテトラフルオロエチレン膜で覆われた2平方センチメートルのタバコ紙スペーサーの小片を置く。次に、アプリケーターツールを使用して、小さな電極ディスクOリングを電極のドームに押し込みます。
次に、電解液で貯水池をよく補充します。大きなOリングを電極ディスクの周りの凹部によく置きます。次に、ディスクを電極チャンバーに取り付け、コントロールユニットに接続します。
2ミリリットルの空気飽和脱イオン水、およびポリテトラフルオロエチレン被覆磁石を反応チャンバに加える。完了したら、チャンバーをコントロールユニットの背面に接続します。温度を摂氏37度に設定し、攪拌速度を100に設定します。
校正前にシステム温度を10分間平衡化させます。正しい温度、攪拌速度、および圧力を確認した後、[校正]タブで[液相校正]オプションを選択して液相校正を実行します。次に、OKを押して、信号がプラトーするのを待ちます。
プラトーに到達したら、OKを押します。次に、約20ミリグラムの亜ジチオン酸ナトリウムを加えて、チャンバー内にゼロ酸素を確立する。もう一度OKを押し、信号がプラトーするのを待ってから、[保存]ボタンをクリックしてキャリブレーションを受け入れます。テトラフェニルホスホニウムまたはTPP選択的電極アセンブリを調製するには、シリンジおよび柔軟な針を使用して、TPP選択的電極チップを10ミリモルのTPP溶液で充填する。
電極先端を充填している間は気泡を避けてください。電極ホルダーキャップを緩めて、内部参照電極をTPPチップに挿入します。完了したら、参照電極と電極ホルダーを含むTPP選択電極装置を組み立てます。
キャップを締めて先端を固定します。次に、ケーブルをコントロールボックスの補助ポートとTPP電極ホルダーに接続します。TPP選択電極と参照電極をイオン選択電極用の適合プランジャーアセンブリに挿入します。
参照電極をコントロールボックスの参照ポートに接続します。次に、反応チャンバを作製し、気泡を生じさせることなく反応混合物を1ミリリットルの反応チャンバに加える。TPP選択電極と参照電極を配置した適合プランジャーアセンブリを使用してチャンバを閉じます。
チャンバーが閉じられたら、プラスチックチューブで修飾された別のマイクロシリンジを使用して、追加の試薬を反応チャンバーに直接導入します。セットアップの準備ができたら、[移動] を選択して記録を開始します。安定した電圧信号が得られたら、0.1ミリモルのTPP溶液を1マイクロモル刻みで加えてTPP選択電極を較正し、3マイクロモルの最終濃度を達成する。
TPP電圧信号が加算されるたびに対数的に低下する様子を観察します。微量の酸素およびTPPを安定化させた後、プランジャーアセンブリ内の試薬添加口を介して、新たに調製した心筋細胞ミトコンドリア100マイクログラムを反応チャンバに最終濃度0.1ミリグラム/ミリリットルで加える。ミトコンドリアが活性化し、酸素を消費するにつれて、チャンバー内の酸素レベルの低下を観察します。
また、ミトコンドリアが膜電位を生成し、溶液からTPPを取り込むにつれて、TPP電圧信号の急激な増加を見てください。次いで、オリゴマイシン1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを加えて、状態4呼吸を誘導する。ミトコンドリア透過性移行孔、またはmPTPの開放確率を評価するために、漏れ呼吸中の時間にわたる膜電位の低下を観察する。
所望の膜電位に達したら、mPTP阻害剤として1マイクロモルのシクロスポリンAを反応チャンバに追加して、その特定の膜電位におけるmPTPの開放確率を評価する。次に、シクロスポリンA添加前後の酸素消費量および膜電位に対するシクロスポリンAの効果を測定する。同時酸素消費量と膜電位の代表的な曲線では、2つのマイクロモルTPP較正レベルに対して、高い膜電位をゼロ、中間を5、10ミリボルトで低く設定した。
0ミリボルトのミトコンドリアは100%mPTPの閉確率を示し、10ミリボルトのミトコンドリアは100%の開確率を示した。オリゴマイシン添加後、酸素消費量に有意な差は認められず、アデノシン三リン酸またはATP合成酵素が状態2呼吸に最小限に寄与することが示唆された。また、シクロスポリンA添加前後の酸素消費量と膜電位を比較した。
酸素消費速度の低下および膜電位の安定化の増加は、開放mPTPの閉鎖を示した。mPTPが閉じられると、酸素消費速度の低下はなく、膜電位は低下し続けた。結果は、FVB対照およびFmr1ノックアウト心臓ミトコンドリアにおける高および低膜電位における同様の閉および開放mPTP確率を実証した。
中間膜電位において、Fmr1ノックアウト心臓ミトコンドリアは、FVB対照と比較して閉閉mPTP確率の増加を示した。気泡をチャンバに導入してはならないのは、酸素消費量の読み取り値が不安定になり、解釈が困難になるためです。この手順に従って、カルシウム負荷容量を測定することができる。
この方法は、細孔の高いコンダクタンス開口部を評価し、当社の技術の結果を補完します。
