Este protocolo fornece uma nova maneira de investigar a baixa abertura de condutância do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma maneira fácil de medir a probabilidade aberta do poro em função do potencial da membrana mitocondrial. Esta técnica pode ser facilmente aplicada às mitocôndrias isoladas de qualquer sistema de órgãos e espécies.
Comece com a calibração do eletrodo de oxigênio colocando uma queda de 50% da solução de eletrólito de cloreto de potássio em cima da cúpula do disco eletrodo. Coloque um pequeno pedaço de dois centímetros quadrados de papel de cigarro espaçado com um pedaço ligeiramente maior de membrana politetrafluoroetileno sobre a gota de eletrólito. Em seguida, use a ferramenta aplicadora para empurrar o pequeno disco de eletrodo O-ring sobre a cúpula do eletrodo.
Em seguida, cubra bem o reservatório com a solução de eletrólitos. Coloque bem o o-ring maior no recreio ao redor do disco de eletrodos. Em seguida, instale o disco na câmara de eletrodos e conecte-o à unidade de controle.
Adicione dois mililitros de água desordenada a ar, e o ímã revestido de politetrafluoroetileno à câmara de reação. Quando terminar, conecte a câmara à parte traseira da unidade de controle. Coloque a temperatura em 37 graus Celsius, e a velocidade de agitação para 100.
Deixe a temperatura do sistema equilibrar por 10 minutos antes da calibração. Depois de garantir a temperatura correta, a velocidade de agitação e a pressão, sob a guia Calibração, selecione a opção Calibração da fase líquida para realizar a calibração da fase líquida. Em seguida, pressione OK, e espere o sinal para planalto.
Uma vez que o planalto é alcançado, pressione OK. Em seguida, adicione cerca de 20 miligramas de dithionita de sódio para estabelecer zero oxigênio na câmara. Novamente pressione OK e aguarde o sinal para planar antes de clicar no botão Salvar para aceitar a calibração. Para preparar o tetrafenilfosfônio, ou montagem de eletrodo seletivo TPP, encha a ponta de eletrodo seletivo TPP com uma solução TPP de 10 mililitros usando uma seringa e uma agulha flexível.
Evite bolhas de ar enquanto encha a ponta do eletrodo. Solte a tampa do suporte do eletrodo para inserir o eletrodo de referência interna na ponta TPP. Quando feito, monte o aparelho de eletrodo seletivo TPP, incluindo o eletrodo de referência e o suporte de eletrodos.
Aperte a tampa para fixar a ponta. Em seguida, conecte o cabo à porta auxiliar da caixa de controle e ao suporte de eletrodos TPP. Insira os eletrodos seletivos e de referência TPP no conjunto adaptado do êmbolo para eletrodos seletivos de íons.
Conecte o eletrodo de referência à porta de referência da caixa de controle. Em seguida, para preparar a câmara de reação, adicione um mililitro da mistura de reação à câmara de reação sem criar bolhas de ar. Feche a câmara usando o conjunto de êmbolo adaptado com os eletrodos de referência e seletivos TPP no lugar.
Uma vez que a câmara esteja fechada, introduza reagentes adicionais diretamente na câmara de reação usando micro-seringas separadas modificadas com tubos plásticos. Quando a configuração estiver pronta, selecione Ir para iniciar a gravação. Uma vez obtido um sinal de tensão estável, calibrar o eletrodo seletivo TPP adicionando um incremento micromolar de uma solução TPP de 0,1 milimiliar para alcançar uma concentração final de três micromolar.
Observe o declínio logarítmico no sinal de tensão TPP a cada adição. Após estabilizar os traços de oxigênio e TPP, adicione 100 microgramas de mitocôndrias cardiomiócitos recém-preparadas à câmara de reação através da porta de adição de reagentes no conjunto do êmbolo a uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro. Observe a diminuição dos níveis de oxigênio na câmara à medida que as mitocôndrias se energizam e consomem oxigênio.
Além disso, veja o aumento abrupto do sinal de tensão TPP à medida que as mitocôndrias geram um potencial de membrana e tomam TPP da solução. Em seguida, adicione 2,5 microgramas por oligomicina mililitro para induzir a respiração do Estado 4. Para avaliar a probabilidade aberta do poro de transição de permeabilidade mitocondrial, ou mPTP, observe o declínio do potencial da membrana ao longo do tempo durante a respiração do vazamento.
Uma vez alcançado o potencial de membrana desejado, adicione um micromolar ciclosporina A como inibidor de mPTP à câmara de reação para avaliar a probabilidade aberta do mPTP nesse potencial de membrana específico. Em seguida, meça o efeito da ciclosporina A no consumo de oxigênio e no potencial da membrana antes e depois da ciclosporina A adição. Nas curvas representativas do consumo simultâneo de oxigênio e potencial de membrana, o alto potencial de membrana foi fixado em zero, intermediário a cinco e baixo em 10 milívolos em relação ao nível de calibração TPP de micromolar.
As mitocôndrias em zero milvolts apresentaram probabilidade fechada de 100% mPTP, e em 10 milívolos apresentaram probabilidade 100% aberta. Após a adição de oligomicina, não foi observada uma diferença significativa no consumo de oxigênio, sugerindo que o triphosfato de adenosina, ou synthase ATP, contribui minimamente para a respiração do Estado 2. Além disso, foram comparadas a taxa de consumo de oxigênio e o potencial de membrana antes e depois da ciclosporina A.
Uma diminuição da taxa de consumo de oxigênio e um aumento na estabilização do potencial de membrana indicaram o fechamento de um MPTP aberto. Quando o PMP está fechado, não houve diminuição na taxa de consumo de oxigênio, e o potencial de membrana continuou a cair. Os resultados demonstraram probabilidades de MPTP fechados e abertos similares em potenciais de alta e baixa membrana no controle FVB e mitocôndrias cardíacas eliminatórias de Fmr1.
No potencial da membrana intermediária, as mitocôndrias cardíacas eliminatórias fmr1 demonstraram aumento da probabilidade de MPTP fechado em comparação com os controles FVB. Nenhuma bolha de ar deve ser introduzida na câmara, pois isso levará a leituras instáveis de consumo de oxigênio, e dificultará a interpretação. Após este procedimento, a capacidade de carregamento de cálcio pode ser medida.
Este método avalia a alta abertura de condutância do poro, e complementa os resultados de nossa técnica.
