Bu protokol, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlik açıklığını araştırmak için yeni bir yol sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak gözeneklerin açık olasılığını ölçmenin kolay bir yolunu sağlamasıdır. Bu teknik, herhangi bir organ sisteminden ve türünden izole edilen mitokondrilere kolayca uygulanabilir.
Elektrot diskinin kubbesinin üzerine %50 damla potasyum klorür elektrolit çözeltisi yerleştirerek oksijen elektrodunun kalibrasyonu ile başlayın. Elektrolit damlasının üzerine biraz daha büyük bir politetrafloroetilen membran parçası ile kaplanmış iki santimetrekarelik sigara kağıdı ara parçasından küçük bir parça yerleştirin. Ardından, küçük elektrot diski O-ring'i elektrotun kubbesi üzerine itmek için aplikatör aletini kullanın.
Daha sonra, rezervuarı elektrolit çözeltisi ile iyice doldurun. Daha büyük O-ring'i elektrot diskinin etrafındaki girintiye iyice yerleştirin. Ardından diski elektrot odasına takın ve kontrol ünitesine bağlayın.
Reaksiyon odasına iki mililitre havaya doymuş deiyonize su ve politetrafloroetilen kaplı mıknatıs ekleyin. İşiniz bittiğinde, odayı kontrol ünitesinin arkasına bağlayın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karıştırma hızını 100'e ayarlayın.
Kalibrasyondan önce sistem sıcaklığının 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Doğru sıcaklığı, karıştırma hızını ve basıncı sağladıktan sonra, Kalibrasyon sekmesi altında, sıvı faz kalibrasyonu gerçekleştirmek için Sıvı Faz Kalibrasyonu seçeneğini belirleyin. Ardından Tamam'a basın ve sinyalin platoya gelmesini bekleyin.
Yaylaya ulaşıldığında Tamam'a basın. Daha sonra odaya sıfır oksijen sağlamak için yaklaşık 20 miligram sodyum ditionit ekleyin. Yine, OK tuşuna basın ve kalibrasyonu kabul etmek için Kaydet düğmesine tıklamadan önce sinyalin platoya gelmesini bekleyin. Tetrafenilfosfonyum veya TPP seçici elektrot tertibatını hazırlamak için, TPP seçici elektrot ucunu bir şırınga ve esnek bir iğne kullanarak 10 milimolar TPP çözeltisi ile doldurun.
Elektrot ucunu doldururken hava kabarcıklarından kaçının. Dahili referans elektrodunu TPP ucuna yerleştirmek için elektrot tutucu kapağını gevşetin. İşiniz bittiğinde, referans elektrodu ve elektrot tutucu dahil olmak üzere TPP seçici elektrot aparatını monte edin.
Ucu sabitlemek için kapağı sıkın. Ardından kabloyu kontrol kutusunun yardımcı portuna ve TPP elektrot tutucusuna bağlayın. TPP seçici ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin.
Referans elektrodunu kontrol kutusunun referans portuna bağlayın. Daha sonra, reaksiyon odasını hazırlamak için, hava kabarcıkları oluşturmadan reaksiyon odasına bir mililitre reaksiyon karışımı ekleyin. TPP seçici ve referans elektrotları yerindeyken, uyarlanmış piston tertibatını kullanarak odayı kapatın.
Oda kapatıldıktan sonra, plastik borularla modifiye edilmiş ayrı mikro şırıngalar kullanarak doğrudan reaksiyon odasına ek reaktifler sürün. Kurulum hazır olduğunda, kayda başlamak için Git ' i seçin. Kararlı bir voltaj sinyali elde edildikten sonra, üç mikromolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 0.1 milimolar TPP çözeltisinin bir mikromolar artışını ekleyerek TPP seçici elektrodu kalibre edin.
Her eklemede TPP voltaj sinyalindeki logaritmik düşüşü gözlemleyin. Oksijen ve TPP izlerini stabilize ettikten sonra, piston tertibatındaki reaktif ekleme portu aracılığıyla reaksiyon odasına mililitre başına 0.1 miligramlık son konsantrasyona 100 mikrogram taze hazırlanmış kardiyomiyosit mitokondri ekleyin. Mitokondri enerjilendirildikçe ve oksijen tüketirken odadaki oksijen seviyelerindeki düşüşü gözlemleyin.
Ayrıca, mitokondri bir membran potansiyeli ürettiği ve çözeltiden TPP'yi aldığı için TPP voltaj sinyalindeki ani artışa bakın. Daha sonra Devlet 4 solunumunu indüklemek için mililitre oligomisin başına 2.5 mikrogram ekleyin. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin veya mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için, sızıntı solunumu sırasında zaman içinde membran potansiyelindeki düşüşü gözlemleyin.
İstenilen membran potansiyeline ulaşıldıktan sonra, mPTP'nin bu spesifik membran potansiyelindeki açık olasılığını değerlendirmek için reaksiyon odasına bir mPTP inhibitörü olarak bir mikromolar siklosporin A ekleyin. Daha sonra siklosporin A'nın siklosporin A ilavesinden önce ve sonra oksijen tüketimi ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini ölçün. Eşzamanlı oksijen tüketimi ve membran potansiyelinin temsili eğrilerinde, iki mikromolar TPP kalibrasyon seviyesine göre yüksek membran potansiyeli sıfır, orta beş ve düşük 10 milivolt olarak ayarlanmıştır.
Sıfır milivolttaki mitokondri% 100 mPTP kapalı olasılık sergiledi ve 10 milivoltta% 100 açık olasılık sergiledi. Oligomisin ilavesinden sonra, oksijen tüketiminde önemli bir fark gözlenmemiştir, bu da adenozin trifosfatın veya ATP sentazın Devlet 2 solunumuna minimum düzeyde katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, siklosporin A ilavesinden önceki ve sonraki oksijen tüketim hızı ve membran potansiyeli karşılaştırılmıştır.
Oksijen tüketim hızındaki bir azalma ve membran potansiyelinin stabilizasyonundaki bir artış, açık bir mPTP'nin kapandığını gösterdi. mPTP kapatıldığında, oksijen tüketim oranında bir azalma olmadı ve membran potansiyeli düşmeye devam etti. Sonuçlar, FVB kontrolünde ve Fmr1 nakavt kardiyak mitokondrisinde yüksek ve düşük membran potansiyellerinde benzer kapalı ve açık mPTP olasılıklarını göstermiştir.
Ara membran potansiyelinde, Fmr1 nakavt kardiyak mitokondri, FVB kontrollerine kıyasla kapalı mPTP olasılığının arttığını göstermiştir. Odaya hava kabarcıkları sokulmamalıdır, çünkü bu dengesiz oksijen tüketimi okumalarına yol açacak ve yorumlamayı zorlaştıracaktır. Bu prosedürü takiben, kalsiyum yükleme kapasitesi ölçülebilir.
Bu yöntem, gözeneklerin yüksek iletkenlik açıklığını değerlendirir ve tekniğimizin sonuçlarını tamamlar.
