Этот протокол обеспечивает новый способ исследования открытия низкой проводимости переходной поры митохондриальной проницаемости. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает простой способ измерения открытой вероятности поры в зависимости от потенциала митохондриальной мембраны. Этот метод может быть легко применен к митохондриям, выделенным из любой системы органов и видов.
Начинают с калибровки кислородного электрода, помещая каплю 50% раствора электролита хлорида калия поверх купола электродного диска. Поместите небольшой кусочек сигаретной бумаги площадью два квадратных сантиметра, покрытый немного большим куском политетрафторэтиленовой мембраны над каплей электролита. Затем используйте инструмент аппликатора, чтобы протолкнуть небольшое уплотнительное кольцо электродного диска над куполом электрода.
Далее хорошо доливаем резервуар раствором электролита. Поместите большее уплотнительное кольцо в углубление вокруг электродного диска. Затем установите диск в электродную камеру, и подключите его к блоку управления.
Добавьте два миллилитра насыщенной воздухом деионизированной воды и магнит с политетрафторэтиленовым покрытием в реакционную камеру. По завершении подключите камеру к задней части блока управления. Установите температуру на 37 градусов Цельсия, а скорость перемешивания на 100.
Уравновешивайте температуру системы в течение 10 минут перед калибровкой. После обеспечения правильной температуры, скорости перемешивания и давления на вкладке Калибровка выберите параметр Калибровка жидкой фазы для выполнения калибровки жидкой фазы. Затем нажмите OK и дождитесь выхода сигнала на плато.
Как только плато будет достигнуто, нажмите OK. Затем добавьте около 20 миллиграммов дитионита натрия, чтобы установить нулевой кислород в камере. Снова нажмите OK и подождите, пока сигнал стабилизируется, прежде чем нажать кнопку Сохранить, чтобы принять калибровку. Чтобы приготовить тетрафенилфосфоний, или TPP-селективный электрод в сборе, заполните наконечник электрода TPP-селективным 10-миллимолярным раствором TPP с использованием шприца и гибкой иглы.
Избегайте пузырьков воздуха при заполнении наконечника электрода. Ослабьте крышку держателя электрода, чтобы вставить внутренний опорный электрод в наконечник TPP. Когда это будет сделано, соберите TPP-селективный электродный аппарат, включая электрод сравнения и держатель электрода.
Затяните колпачок, чтобы закрепить наконечник. Затем подключите кабель к вспомогательному порту блока управления и держателю электрода ТЭС. Вставьте электроды TPP-селективного и эталонного происхождения в адаптированный плунжерный узел для ионселективных электродов.
Подключите опорный электрод к опорному порту блока управления. Далее, чтобы подготовить реакционную камеру, добавляют один миллилитр реакционной смеси в реакционную камеру без образования пузырьков воздуха. Закройте камеру с помощью адаптированного плунжерного узла с электродами TPP-селективными и эталонными электродами.
После закрытия камеры вводят дополнительные реагенты непосредственно в реакционную камеру с помощью отдельных микрошприцев, модифицированных пластиковыми трубками. Когда настройка будет готова, нажмите кнопку Перейти, чтобы начать запись. Как только будет получен сигнал стабильного напряжения, откалибруйте TPP-селективный электрод, добавив один микромолярный приращение 0,1 миллимолярного раствора TPP для достижения конечной концентрации трех микромоляров.
Наблюдайте логарифмическое снижение сигнала напряжения TPP с каждым добавлением. После стабилизации следов кислорода и ТЭС добавьте 100 мкг свежеприготовленных митохондрий кардиомиоцитов в реакционную камеру через порт добавления реагента в плунжерном сборе до конечной концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. Наблюдайте за снижением уровня кислорода в камере, когда митохондрии заряжаются энергией и потребляют кислород.
Кроме того, посмотрите на резкое увеличение сигнала напряжения TPP, поскольку митохондрии генерируют мембранный потенциал и поглощают TPP из раствора. Затем добавляют 2,5 мкг на миллилитр олигомицина, чтобы вызвать дыхание в состоянии 4. Чтобы оценить открытую вероятность перехода поры митохондриальной проницаемости, или mPTP, наблюдают снижение мембранного потенциала с течением времени во время утечек дыхания.
Как только желаемый мембранный потенциал достигнут, добавьте один микромолярный циклоспорин А в качестве ингибитора mPTP в реакционную камеру для оценки открытой вероятности mPTP при этом конкретном мембранном потенциале. Затем измеряют влияние циклоспорина А на потребление кислорода и мембранный потенциал до и после добавления циклоспорина А. В репрезентативных кривых одновременного потребления кислорода и мембранного потенциала высокий мембранный потенциал был установлен на нуле, промежуточный — на пять, а низкий — на 10 милливольт относительно уровня калибровки двух микромолярных ТЭС.
Митохондрии при нуле милливольт демонстрировали 100% mPTP замкнутую вероятность, а при 10 милливольтах — 100% открытую вероятность. После добавления олигомицина существенной разницы в потреблении кислорода не наблюдалось, что позволяет предположить, что аденозинтрифосфат, или АТФ-синтаза, минимально способствует дыханию в состоянии 2. Кроме того, сравнивали скорость потребления кислорода и мембранный потенциал до и после добавления циклоспорина А.
Снижение скорости потребления кислорода и увеличение стабилизации мембранного потенциала свидетельствовали о закрытии открытого мПТП. При закрытии mPTP не наблюдалось снижения скорости потребления кислорода, а мембранный потенциал продолжал падать. Результаты продемонстрировали аналогичные закрытые и открытые вероятности mPTP при высоких и низких мембранных потенциалах в контроле FVB и нокаутированных сердечных митохондриях Fmr1.
При промежуточном мембранном потенциале нокаутирующие сердечные митохондрии Fmr1 продемонстрировали повышенную вероятность закрытого mPTP по сравнению с контролем FVB. В камеру не должны вводиться пузырьки воздуха, так как это приведет к нестабильным показаниям потребления кислорода и затруднит интерпретацию. После этой процедуры можно измерить нагрузочную способность кальция.
Этот метод оценивает высокую проводимость открытия поры, и дополняет результаты нашей методики.
