Dieses Protokoll bietet eine neue Möglichkeit, die niedrige Leitfähigkeitsöffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Möglichkeit bietet, die offene Wahrscheinlichkeit der Pore als Funktion des mitochondrialen Membranpotentials zu messen. Diese Technik kann leicht auf Mitochondrien angewendet werden, die aus jedem Organsystem und jeder Spezies isoliert sind.
Beginnen Sie mit der Kalibrierung der Sauerstoffelektrode, indem Sie einen Tropfen von 50% Kaliumchlorid-Elektrolytlösung auf die Kuppel der Elektrodenscheibe legen. Legen Sie ein kleines Stück von zwei Quadratzentimetern Zigarettenpapier-Abstandshalter, der mit einem etwas größeren Stück Polytetrafluorethylenmembran bedeckt ist, über den Elektrolyttropfen. Verwenden Sie dann das Applikatorwerkzeug, um den kleinen Elektrodenscheiben-O-Ring über die Kuppel der Elektrode zu schieben.
Als nächstes füllen Sie das Reservoir gut mit der Elektrolytlösung auf. Platzieren Sie den größeren O-Ring in der Aussparung um die Elektrodenscheibe. Installieren Sie dann die Disc in der Elektrodenkammer und schließen Sie sie an die Steuereinheit an.
Geben Sie zwei Milliliter luftgesättigtes entionisiertes Wasser und den mit Polytetrafluorethylen beschichteten Magneten in die Reaktionskammer. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Kammer an die Rückseite der Steuereinheit an. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und die Rührgeschwindigkeit auf 100 Grad ein.
Lassen Sie die Systemtemperatur vor der Kalibrierung 10 Minuten lang ausgleichen. Nachdem Sie die richtige Temperatur, Rührgeschwindigkeit und den richtigen Druck sichergestellt haben, wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die Option Flüssigkeitsphasenkalibrierung aus, um eine Flüssigphasenkalibrierung durchzuführen. Drücken Sie dann OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat.
Sobald das Plateau erreicht ist, drücken Sie OK. Dann fügen Sie etwa 20 Milligramm Natriumdithionit hinzu, um Null Sauerstoff in der Kammer zu etablieren. Drücken Sie erneut OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat, bevor Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken, um die Kalibrierung zu akzeptieren. Um die tetraphenylphosphonium- oder TPP-selektive Elektrodenanordnung herzustellen, füllen Sie die TPP-selektive Elektrodenspitze mit einer 10-millimolaren TPP-Lösung unter Verwendung einer Spritze und einer flexiblen Nadel.
Vermeiden Sie Luftblasen beim Befüllen der Elektrodenspitze. Lösen Sie die Elektrodenhalterkappe, um die interne Referenzelektrode in die TPP-Spitze einzuführen. Wenn Sie fertig sind, montieren Sie die TPP-selektive Elektrodenvorrichtung, einschließlich der Referenzelektrode und des Elektrodenhalters.
Ziehen Sie die Kappe fest, um die Spitze zu sichern. Schließen Sie dann das Kabel an den AUX-Port der Steuerbox und den TPP-Elektrodenhalter an. Setzen Sie die TPP-selektiven und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein.
Schließen Sie die Referenzelektrode an den Referenzport der Steuerbox an. Als nächstes, um die Reaktionskammer vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter des Reaktionsgemisches in die Reaktionskammer hinzu, ohne Luftblasen zu erzeugen. Schließen Sie die Kammer mit der angepassten Kolbenbaugruppe mit den TPP-selektiven und Referenzelektroden.
Sobald die Kammer geschlossen ist, führen Sie zusätzliche Reagenzien direkt in die Reaktionskammer ein, indem Sie separate Mikrospritzen verwenden, die mit Kunststoffschläuchen modifiziert sind. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie Gehe zu, um die Aufnahme zu starten. Sobald ein stabiles Spannungssignal erhalten wurde, kalibrieren Sie die TPP-selektive Elektrode, indem Sie ein Mikromolar-Inkrement einer 0,1-millimolaren TPP-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von drei Mikromolaren zu erreichen.
Beobachten Sie den logarithmischen Rückgang des TPP-Spannungssignals bei jeder Addition. Nach der Stabilisierung der Sauerstoff- und TPP-Spuren werden 100 Mikrogramm frisch zubereitete Kardiomyozytenmitochondrien über den Reagenzzugabeanschluss in der Kolbenanordnung in die Reaktionskammer gegeben, bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter. Beobachten Sie die Abnahme des Sauerstoffgehalts in der Kammer, wenn die Mitochondrien energetisiert werden und Sauerstoff verbrauchen.
Sehen Sie auch den abrupten Anstieg des TPP-Spannungssignals, da die Mitochondrien ein Membranpotential erzeugen und TPP aus der Lösung aufnehmen. Dann fügen Sie 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin hinzu, um die Atmung des Zustands 4 zu induzieren. Um die offene Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) zu beurteilen, beobachten Sie den Rückgang des Membranpotentials im Laufe der Zeit während der Leckrespiration.
Sobald das gewünschte Membranpotential erreicht ist, fügen Sie ein mikromolares Cyclosporin A als mPTP-Inhibitor in die Reaktionskammer ein, um die offene Wahrscheinlichkeit des mPTP bei diesem spezifischen Membranpotential zu bewerten. Messen Sie dann die Wirkung von Cyclosporin A auf den Sauerstoffverbrauch und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Addition. In den repräsentativen Kurven des gleichzeitigen Sauerstoffverbrauchs und des Membranpotentials wurde das hohe Membranpotential auf Null, das mittlere auf fünf und das niedrige auf 10 Millivolt relativ zum zweimikromolaren TPP-Kalibrierniveau festgelegt.
Die Mitochondrien bei null Millivolt zeigten eine geschlossene Wahrscheinlichkeit von 100% mPTP und bei 10 Millivolt eine offene Wahrscheinlichkeit von 100%. Nach der Oligomycin-Addition wurde kein signifikanter Unterschied im Sauerstoffverbrauch beobachtet, was darauf hindeutet, dass Adenosintriphosphat oder ATP-Synthase minimal zur Atmung von Zustand 2 beiträgt. Weiterhin wurden die Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Zugabe verglichen.
Eine Abnahme des Sauerstoffverbrauchs und eine Erhöhung der Stabilisierung des Membranpotentials deuteten auf den Verschluss eines offenen mPTP hin. Wenn das mPTP geschlossen ist, gab es keine Abnahme der Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential sank weiter. Die Ergebnisse zeigten ähnliche geschlossene und offene mPTP-Wahrscheinlichkeiten bei hohen und niedrigen Membranpotentialen in den FVB-Kontroll- und Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien.
Am intermediären Membranpotential zeigten die Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien eine erhöhte geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit im Vergleich zu den FVB-Kontrollen. Es dürfen keine Luftblasen in die Kammer eingeführt werden, da dies zu instabilen Sauerstoffverbrauchswerten führt und die Interpretation erschwert. Nach diesem Verfahren kann die Calciumbeladungskapazität gemessen werden.
Diese Methode bewertet die hohe Leitfähigkeitsöffnung der Pore und ergänzt die Ergebnisse unserer Technik.
