Questo protocollo fornisce un nuovo modo per studiare l'apertura a bassa conduttanza del poro di transizione della permeabilità mitocondriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un modo semplice per misurare la probabilità aperta del poro in funzione del potenziale di membrana mitocondriale. Questa tecnica può essere facilmente applicata ai mitocondri isolati da qualsiasi sistema di organi e specie.
Iniziare con la calibrazione dell'elettrodo di ossigeno posizionando una goccia di soluzione elettrolitica di cloruro di potassio al 50% sulla parte superiore della cupola del disco dell'elettrodo. Posizionare un piccolo pezzo di distanziatore di carta per sigarette di due centimetri quadrati coperto con un pezzo leggermente più grande di membrana di politetrafluoroetilene sopra la goccia di elettrolita. Quindi utilizzare lo strumento applicatore per spingere il piccolo disco dell'elettrodo O-ring sopra la cupola dell'elettrodo.
Quindi, rabboccare bene il serbatoio con la soluzione elettrolitica. Posizionare bene l'O-ring più grande nella rientranza attorno al disco dell'elettrodo. Quindi installare il disco nella camera degli elettrodi e collegarlo all'unità di controllo.
Aggiungere due millilitri di acqua deionizzata satura d'aria e il magnete rivestito in politetrafluoroetilene alla camera di reazione. Al termine, collegare la camera alla parte posteriore dell'unità di controllo. Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e la velocità di agitazione a 100.
Lasciare equilibrare la temperatura del sistema per 10 minuti prima della calibrazione. Dopo aver verificato la temperatura, la velocità di agitazione e la pressione corrette, nella scheda Calibrazione selezionare l'opzione Calibrazione fase liquida per eseguire la calibrazione in fase liquida. Quindi premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi.
Una volta raggiunto l'altopiano, premere OK. Quindi aggiungere circa 20 milligrammi di ditionite di sodio per stabilire zero ossigeno nella camera. Ancora una volta, premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi prima di fare clic sul pulsante Salva per accettare la calibrazione. Per preparare il tetrafenilfosfonio, o gruppo elettrodo selettivo TPP, riempire la punta dell'elettrodo selettivo TPP con una soluzione TPP da 10 millimolari utilizzando una siringa e un ago flessibile.
Evitare bolle d'aria durante il riempimento della punta dell'elettrodo. Allentare il cappuccio portaelettrodo per inserire l'elettrodo di riferimento interno nella punta TPP. Al termine, assemblare l'apparecchiatura per elettrodi selettivi TPP, compresi l'elettrodo di riferimento e il supporto dell'elettrodo.
Stringere il cappuccio per fissare la punta. Quindi collegare il cavo alla porta ausiliaria della scatola di controllo e al supporto dell'elettrodo TPP. Inserire gli elettrodi TPP-selettivi e di riferimento nel gruppo stantuffo adattato per elettrodi iono-selettivi.
Collegare l'elettrodo di riferimento alla porta di riferimento della scatola di controllo. Successivamente, per preparare la camera di reazione, aggiungere un millilitro della miscela di reazione alla camera di reazione senza creare bolle d'aria. Chiudere la camera utilizzando il gruppo stantuffo adattato con gli elettrodi selettivi e di riferimento TPP in posizione.
Una volta chiusa la camera, introdurre reagenti aggiuntivi direttamente nella camera di reazione utilizzando microsiringhe separate modificate con tubi di plastica. Quando la configurazione è pronta, seleziona Vai per avviare la registrazione. Una volta ottenuto un segnale di tensione stabile, calibrare l'elettrodo selettivo TPP aggiungendo un incremento micromolare di una soluzione TPP da 0,1 millimolari per ottenere una concentrazione finale di tre micromolari.
Osservare il declino logaritmico del segnale di tensione TPP con ogni aggiunta. Dopo aver stabilizzato le tracce di ossigeno e TPP, aggiungere 100 microgrammi di mitocondri cardiomiocitari appena preparati alla camera di reazione tramite la porta di aggiunta del reagente nel gruppo stantuffo fino a una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Osservare la diminuzione dei livelli di ossigeno nella camera mentre i mitocondri diventano energizzati e consumano ossigeno.
Inoltre, vedere il brusco aumento del segnale di tensione TPP poiché i mitocondri generano un potenziale di membrana e assorbono TPP dalla soluzione. Quindi aggiungere 2,5 microgrammi per millilitro oligomicina per indurre la respirazione allo stato 4. Per valutare la probabilità aperta del poro di transizione della permeabilità mitocondriale, o mPTP, osservare il declino del potenziale di membrana nel tempo durante la respirazione della perdita.
Una volta raggiunto il potenziale di membrana desiderato, aggiungere una ciclosporina micromolare A come inibitore mPTP alla camera di reazione per valutare la probabilità aperta dell'mPTP a quello specifico potenziale di membrana. Quindi misurare l'effetto della ciclosporina A sul consumo di ossigeno e sul potenziale di membrana prima e dopo l'aggiunta di ciclosporina A. Nelle curve rappresentative del consumo simultaneo di ossigeno e del potenziale di membrana, l'alto potenziale di membrana è stato impostato a zero, intermedio a cinque e basso a 10 millivolt rispetto al livello di calibrazione TPP micromolare.
I mitocondri a zero millivolt mostravano una probabilità chiusa del 100% mPTP e a 10 millivolt mostravano una probabilità aperta del 100%. Dopo l'aggiunta di oligomicina, non è stata osservata una differenza significativa nel consumo di ossigeno, suggerendo che l'adenosina trifosfato, o ATP sintasi, contribuisce minimamente alla respirazione dello Stato 2. Inoltre, sono stati confrontati il tasso di consumo di ossigeno e il potenziale di membrana prima e dopo l'aggiunta di ciclosporina A.
Una diminuzione del tasso di consumo di ossigeno e un aumento della stabilizzazione del potenziale di membrana hanno indicato la chiusura di un mPTP aperto. Quando l'mPTP è chiuso, non c'è stata alcuna diminuzione del tasso di consumo di ossigeno e il potenziale di membrana ha continuato a diminuire. I risultati hanno dimostrato probabilità simili di mPTP chiuso e aperto ad alti e bassi potenziali di membrana nel controllo FVB e nei mitocondri cardiaci knockout Fmr1.
Al potenziale di membrana intermedio, i mitocondri cardiaci knockout Fmr1 hanno dimostrato un aumento della probabilità di mPTP chiuso rispetto ai controlli FVB. Nessuna bolla d'aria deve essere introdotta nella camera, in quanto ciò porterà a letture instabili del consumo di ossigeno e renderà difficile l'interpretazione. Seguendo questa procedura, è possibile misurare la capacità di carico del calcio.
Questo metodo valuta l'apertura ad alta conduttanza del poro e integra i risultati della nostra tecnica.
