يعد التحقيق في سلوك الأكتين باستخدام هذا البروتوكول أمرا مهما لأنه يسمح للمستخدم بفحص ديناميكيات مجموعة البروتين الحركي باستخدام دقة الاصطياد البصري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على قياس ميكانيكا الميوسين داخل التسلسل الهرمي لبنية الأكتين ، على عكس الاتجاه التقليدي أحادي الخيط أحادي المحرك المستخدم في العديد من تجارب الاصطياد البصري. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي طبيعته المعيارية ، والتي تسمح للمستخدم بتخصيص الفحص لنظام الهيكل الخلوي الهرمي الذي يختاره.
للبدء ، ضع قطعتين من الشريط اللاصق على الوجهين في منتصف شريحة المجهر على بعد ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من بعضها البعض. ثم قم بتمزيق أو قطع الشريط الزائد المعلق على حافة الشريحة. بعد ذلك ، أضف زلة الغطاء المطلية ب PLL أعلى الشريط بشكل عمودي على المحور الطويل لشريحة المجهر لتشكيل قناة.
باستخدام أنبوب صغير لضغط الغطاء ، انزلق على الشريط والمجهر ، حرك جيدا حتى يصبح الشريط شفافا ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات في الشريط لأن ذلك قد يتسبب في تسرب من قناة التدفق. أضف 15 ميكرولترا من أكتين الرودامين المخفف إلى خلية تدفق PLL وفتيل المحلول الزائد من خلال خلية التدفق ، لكن لا تسمح لقناة التدفق أن تجف. ثم احتضان لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة.
بعد ذلك ، قم بإعداد ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول الكازين في مخزن بلمرة الأكتين وأضف 15 ميكرولتر من المحلول لمنع الارتباط غير المحدد للمكونات اللاحقة. ثم احتضان لمدة خمس دقائق في غرفة الرطوبة. بعد ذلك ، أضف التركيز المطلوب من الميوسين إلى الأكتين المحضر بيوتينيل وتعليق الخرز وحركه برفق بطرف ماصة.
ثم ، أضف على الفور 15 ميكرولتر من التعليق مع تركيز الميوسين المطلوب إلى خلية التدفق واحتضانه لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أغلق الأطراف المفتوحة لخلية التدفق بطلاء الأظافر لمنع التبخر أثناء التصوير وتجارب الاصطياد البصري. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، قم بتشغيل الليزر باستخدام زر طاقة الليزر في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة إلى 50 ملي واط واتركه يستقر لمدة 30 دقيقة.
انقر بالتتابع على أزرار الإضاءة والكاميرا والهدف وحركة المسرح داخل البرنامج لإظهار تلك النوافذ للعرض والتلاعب أثناء التجربة. قم بتشغيل إضاءة المجهر بالنقر فوق الزر تشغيل / إيقاف وضبطه على أقصى طاقة عن طريق النقر فوق الشريط وسحبه إلى اليمين. افتح منطقة العينة وأزل حامل العينة من مرحلة المجهر.
ثم أضف خلية التدفق وقم بتثبيتها بحاملات العينات المعدنية ، مما يضمن أن زلة الغطاء في الأسفل. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من ماء التناضح العكسي إلى مركز الهدف السفلي وأعد إدخال مرحلة العينة. ثم ارفع الهدف السفلي باستخدام L2 على جهاز التحكم عن بعد حتى تلامس حبة الماء انزلاق الغطاء.
بعد ذلك ، قم بخفض الهدف العلوي حتى يتم الوصول إلى حوالي نصف المسافة إلى خلية التدفق باستخدام R2 على وحدة التحكم عن بعد. بعد ذلك ، أضف 170 ميكرولترا من ماء RO إلى الجزء العلوي من خلية التدفق مباشرة أسفل الهدف العلوي وقم بخفض الهدف العلوي حتى يكسر التوتر السطحي للماء ويشكل هلالة. بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر باستخدام لوحة الأسهم الموجودة على وحدة التحكم عن بعد حتى يتم الوصول إلى حافة الشريط المجاور لقناة التدفق ثم أغلق باب العينة.
باستخدام نافذة الهدف في الشاشة ، قم بإحضار حافة الشريط والتركيز عن طريق إحضار الهدف السفلي المسمى Laser Objective لأعلى بالنقر فوق السهم العلوي والهدف العلوي بالنقر فوق السهم السفلي باستخدام عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة. ابحث عن حبة عائمة وحبسها بالنقر فوق زر غالق المصيدة ، والذي سيفتح الغالق ويسمح لليزر الملائمة بضرب العينة. ثم انقر فوق مؤشر الملائمة على الشاشة واسحبه لتحريك موقع ليزر الملائمة.
بمجرد محاصرتها ، قم بمعايرة الخرزة بالنقر فوق زر المعايرة. ثم ، انقر فوق الإعدادات واكتب قطر الخرزة ودرجة حرارة المرحلة الموجودة في الجزء السفلي الأيسر من نافذة البرنامج. بعد ذلك ، انقر فوق Trap 1 ، ثم على X Signal وقم بإجراء ملاءمة تردد الزاوية بالنقر فوق تشغيل.
ثم انقر واسحب داخل النافذة لتحسين ملاءمة الوظيفة. بعد ذلك ، انقر فوق استخدامه لقيم الحساسية والصلابة ثم اقبل القيم. بعد ذلك ، أغلق النافذة.
ابحث عن حزمة أكتوميوسين من خلال البحث عن الخرز المرتبط ب AFs على سطح زلة الغطاء ومن خلال البحث عن كل من AFs الفلورية المترجمة بشكل مشترك. قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض واستخدم مكعب المرشح المناسب لتصوير كل خيوط أكتين عن طريق تدوير البرج. بمجرد التحقق ، قم بحبس الخرزة المرفقة بالخيوط العلوية للحزمة بالنقر فوق زر مصراع المصيدة.
بعد ذلك ، قم بتسجيل البيانات بالنقر فوق زر راسم الذبذبات باستخدام عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة. لتصور القياسات دون تسجيل البيانات ، انقر فوق ابدأ ثم انقر فوق الحفظ التلقائي لحفظ جميع البيانات. لتسجيل القياسات ، انقر فوق بدء التسجيل واختر البيانات التي سيتم تصورها في الوقت الفعلي عن طريق الاختيار من القائمة المنسدلة X Signal أو Y Signal.
يظهر تتبع القوة لمحركات الميوسين الهيكلية التي تولد القوة داخل التسلسل الهرمي الهيكلي للأكتين في المختبر منحدرا ثابتا في القوة حتى يتم الوصول إلى الهضبة خلال دقيقتين إلى خمس دقائق. ومع ذلك ، لوحظ أيضا أن بعض حزم الأكتوميوسين التي لا تولد أي قوة محصلة وتظهر آثار القوة كضوضاء أساسية أو لا تظهر أي زيادة صافية كبيرة في القوة خلال 90 ثانية بسبب انخفاض تركيز المحرك أو الاتجاه الموازي غير المواتي للخيوط. سيمهد تطوير البروتوكول هذا الطريق نحو بناء فحوصات هيكلية خلوية أكثر تعقيدا في المختبر ستساعد بشكل أكبر في نمذجة المهام الخلوية واسعة النطاق ، مثل انقسام الخلايا وتقلص العضلات من الأسفل إلى الأعلى.
