이 프로토콜을 사용하여 액틴 거동을 조사하는 것은 사용자가 광학 트래핑의 정밀도를 사용하여 모터 단백질 앙상블 역학을 조사할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 광학 트래핑 실험에 사용되는 기존의 단일 모터 단일 필라멘트 방향과 달리 액틴 구조 계층 구조 내에서 미오신 역학을 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 사용자가 선택한 계층적 세포골격 시스템에 대한 분석을 사용자 정의할 수 있는 모듈식 특성입니다.
시작하려면 양면 접착 테이프 두 장을 현미경 슬라이드 중앙에 서로 3-4mm 간격으로 붙입니다. 그런 다음 슬라이드 가장자리에 매달려있는 여분의 테이프를 찢거나 잘라냅니다. 다음으로, 현미경 슬라이드의 장축에 수직인 테이프 위에 PLL 코팅 커버 슬립을 추가하여 채널을 형성합니다.
작은 튜브를 사용하여 커버 슬립을 테이프와 현미경에 압축하고 테이프가 투명해질 때까지 완전히 밀어 테이프에 기포가 생기지 않도록 하여 흐름 채널에서 누출이 발생할 수 있습니다. 희석된 로다민 액틴 15마이크로리터를 PLL 플로우 셀에 추가하고 플로우 셀을 통해 초과 용액을 흡수하되 플로우 채널이 건조되지 않도록 합니다. 이어서, 습도 챔버에서 10분 동안 배양한다.
다음으로, 액틴 중합 완충액에 밀리리터 카제인 용액 당 1 밀리그램을 준비하고 후속 성분의 비특이적 결합을 방지하기 위해 15 마이크로 리터의 용액을 첨가한다. 그런 다음 습도 챔버에서 5 분 동안 배양하십시오. 그 후, 준비된 비오티닐화된 액틴과 비드 현탁액에 원하는 농도의 미오신을 넣고 피펫 팁으로 부드럽게 저어줍니다.
그런 다음 즉시 원하는 미오신 농도와 함께 15 마이크로리터의 현탁액을 유동 세포에 추가하고 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 이미징 및 광학 트래핑 실험 중 증발을 방지하기 위해 매니큐어로 플로우 셀의 열린 끝을 밀봉합니다. 시스템이 준비되면 화면 왼쪽 하단 모서리에 있는 레이저 전원 버튼을 사용하여 레이저를 50밀리와트로 켜고 30분 동안 안정화시킵니다.
소프트웨어 내에서 조명, 카메라, 대물렌즈 및 스테이지 이동 버튼을 순차적으로 클릭하여 실험 중에 보고 조작할 수 있도록 해당 창을 불러옵니다. On/Off 버튼을 클릭하여 현미경 조명을 켜고 막대를 클릭하고 오른쪽 끝까지 드래그하여 최대 전력으로 설정합니다. 샘플 영역을 열고 현미경 스테이지에서 샘플 홀더를 제거합니다.
그런 다음 플로우 셀을 추가하고 금속 샘플 홀더로 고정하여 커버 슬립이 바닥에 있는지 확인합니다. 그런 다음 30마이크로리터의 RO 물을 바닥 대물렌즈 중앙에 추가하고 샘플 스테이지를 다시 삽입합니다. 그런 다음 물 비드가 덮개 슬립에 닿을 때까지 조종기의 L2를 사용하여 하단 대물렌즈를 들어 올립니다.
그런 다음 조종기의 R2를 사용하여 플로우 셀까지의 거리의 약 절반에 도달할 때까지 상단 대물렌즈를 내립니다. 그런 다음 상단 대물렌즈 바로 아래의 플로우 셀 상단에 170마이크로리터의 RO 물을 추가하고 물의 표면 장력을 깨고 메니스커스를 형성할 때까지 상단 대물렌즈를 내립니다. 그런 다음 조종기의 화살표 패드를 사용하여 흐름 채널에 인접한 테이프의 가장자리에 도달할 때까지 현미경 스테이지를 이동한 다음 샘플 도어를 닫습니다.
화면의 목표 창을 사용하여 테이프의 가장자리를 가져오고 위쪽 화살표를 클릭하여 레이저 목표라는 아래쪽 목표를 위로 가져오고 화면 컨트롤을 사용하여 아래쪽 화살표를 클릭하여 위쪽 목표를 가져와 초점을 맞춥니다. 플로팅 비드를 찾아 트랩 셔터 버튼을 클릭하여 트랩하면 셔터가 열리고 트래핑 레이저가 샘플에 닿을 수 있습니다. 그런 다음 화면에서 트랩 커서를 클릭하고 드래그하여 트래핑 레이저의 위치를 이동합니다.
트랩되면 보정 버튼을 클릭하여 비드를 보정합니다. 그런 다음 설정을 클릭하고 소프트웨어 창의 왼쪽 하단에 있는 비드의 직경과 스테이지의 온도를 입력합니다. 그런 다음 트랩 1을 클릭한 다음 X 신호를 클릭하고 실행을 클릭하여 코너 주파수 피팅을 수행합니다.
그런 다음 창 내에서 클릭하고 드래그하여 기능 맞춤을 최적화합니다. 그런 다음 민감도 및 강성 값에 사용을 클릭한 다음 값을 수락합니다. 그런 다음 창을 닫습니다.
커버 슬립 표면에서 AF에 결합된 비드를 검색하고 두 형광 AF를 공동 국소화하여 액토미오신 번들을 찾습니다. 백색 광원을 켜고 적절한 필터 큐브를 사용하여 터렛을 돌려 각 액틴 필라멘트를 이미지화합니다. 확인되면 트랩 셔터 버튼을 클릭하여 번들의 상단 필라멘트에 부착된 비드를 트랩합니다.
그런 다음 화면 컨트롤을 사용하여 오실로스코프 버튼을 클릭하여 데이터를 기록합니다. 데이터를 기록하지 않고 측정값을 시각화하려면 시작을 클릭한 다음 자동 저장을 클릭하여 모든 데이터를 저장합니다. 측정값을 기록하려면 기록 시작을 클릭하고 드롭다운 메뉴 X 신호 또는 Y 신호에서 선택하여 실시간으로 시각화할 데이터를 선택합니다.
구성된 시험관 내 액틴 구조 계층 구조 내에서 힘을 생성하는 골격 미오신 모터의 힘 추적은 2분에서 5분에 걸쳐 고원에 도달할 때까지 꾸준한 상승력을 나타냅니다. 그러나, 임의의 순 힘 및 힘 흔적을 생성하지 않는 일부 액토 미오신 다발은 기준선 노이즈로 나타나거나 낮은 농도의 모터 또는 필라멘트의 불리한 평행 방향으로 인해 90 초 동안 힘의 실질적인 순 증가를 나타내지 않는 것으로 관찰된다. 이 프로토콜 개발은 아래에서 위로 세포 분열 및 근육 수축과 같은 대규모 세포 작업을 모델링하는 데 도움이 될 보다 복잡한 시험관 내 세포골격 분석을 구축하는 길을 열 것입니다.
