Исследование поведения актина с использованием этого протокола имеет важное значение, поскольку оно позволяет пользователю исследовать динамику ансамбля моторных белков, используя точность оптического улавливания. Основным преимуществом этого метода является возможность измерения механики миозина в структурной иерархии актина, в отличие от традиционной одномоторной ориентации с одной нитью, используемой во многих экспериментах по оптическому улавливанию. Еще одним преимуществом этого протокола является его модульный характер, который позволяет пользователю настраивать анализ на иерархическую систему цитоскелетов по своему выбору.
Для начала приложите два куска двусторонней липкой ленты к середине слайда микроскопа на расстоянии от трех до четырех миллиметров друг от друга. Затем порвите или отрежьте лишнюю ленту, которая свисает с края горки. Затем добавьте крышку с ФАПЧ-покрытием поверх ленты перпендикулярно длинной оси слайда микроскопа, чтобы сформировать канал.
Используя небольшую трубку для сжатия крышки, скользите по ленте и микроскопу, тщательно скользите, пока лента не станет прозрачной, гарантируя, что в ленте нет пузырьков, так как это может вызвать утечку из канала потока. Добавьте 15 микролитров разбавленного родаминового актина в проточную ячейку ФАПЧ и пропустите избыток раствора через проточную ячейку, но не дайте каналу потока стать сухим. Затем инкубировать в течение 10 минут в камере влажности.
Далее готовят один миллиграмм на миллилитр казеинового раствора в буфере полимеризации актина и добавляют 15 микролитров раствора для предотвращения неспецифического связывания последующих компонентов. Затем высиживать в течение пяти минут в камере влажности. После этого добавьте желаемую концентрацию миозина к приготовленному биотинилированному актину и бисерной суспензии и осторожно перемешайте кончиком пипетки.
Затем сразу же добавляют 15 микролитров суспензии вместе с желаемой концентрацией миозина в проточную клетку и инкубируют в течение 20 минут. Затем запечатайте открытые концы проточной ячейки лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение во время экспериментов с визуализацией и оптическим улавливанием. Как только система будет готова, включите лазер с помощью кнопки питания лазера в левом нижнем углу экрана до 50 милливатт и дайте ему стабилизироваться в течение 30 минут.
Последовательно нажимайте на кнопки освещения, камеры, объектива и сценического движения в программном обеспечении, чтобы открыть эти окна для просмотра и манипуляции во время эксперимента. Включите подсветку микроскопа, нажав кнопку «Вкл/Выкл» и установив ее на максимальную мощность, щелкнув и перетащив полосу вправо. Откройте область образца и извлеките держатель образца из сцены микроскопа.
Затем добавьте проточную ячейку и закрепите ее металлическими держателями образцов, гарантируя, что крышка скользит по дну. После этого добавьте 30 микролитров воды обратного осмоса в центр нижнего объектива и снова вставьте ступень образца. Затем поднимите нижний объектив с помощью L2 на пульте дистанционного управления до тех пор, пока шарик воды не коснется проскальзывания крышки.
Затем опустите верхнюю цель до тех пор, пока не будет достигнуто около половины расстояния до проточной ячейки с помощью R2 на пульте дистанционного управления. Затем добавьте 170 микролитров воды обратного осмоса в верхнюю часть проточной ячейки непосредственно под верхним объективом и опустите верхний объектив, пока он не нарушит поверхностное натяжение воды и не образует мениск. Затем переместите ступень микроскопа с помощью стрелки на пульте дистанционного управления до тех пор, пока не будет достигнут край ленты, прилегающей к каналу потока, а затем закройте дверцу образца.
Используя окно цели на экране, переместите край ленты и сфокусируйтесь, подняв нижнюю цель с именем Laser Objective вверх, щелкнув верхнюю стрелку, и верхнюю цель, щелкнув нижнюю стрелку с помощью экранных элементов управления. Найдите плавающую бусину и поймайте ее, нажав на кнопку затвора ловушки, которая откроет затвор и позволит улавливающему лазеру ударить по образцу. Затем нажмите на курсор ловушки на экране и перетащите его, чтобы переместить местоположение лазера треппинга.
После попадания в ловушку откалибруйте шарик, нажав на кнопку калибровки. Затем нажмите «Настройки» и введите диаметр шарика и температуру сцены, найденные в левом нижнем углу окна программного обеспечения. Затем нажмите на Trap 1, затем на X Signal и выполните угловую частоту, нажав на Run.
Затем щелкните и перетащите в окно, чтобы оптимизировать подгонку функции. После этого нажмите Использовать его для значений чувствительности и жесткости, а затем примите значения. После этого закройте окно.
Найдите пучок актомиозина, выполнив поиск бусин, связанных с АФ на поверхности крышки, и выполнив поиск обоих флуоресцентных АФ, совместно локализованных. Включите источник белого света и используйте соответствующий куб фильтра для изображения каждой нити накала актина, повернув башню. После проверки задерните бусину, прикрепленную к верхней нити пучка, нажав на кнопку затвора ловушки.
Затем запишите данные, нажав на кнопку осциллографа с помощью экранных элементов управления. Чтобы визуализировать измерения без записи данных, нажмите «Пуск», а затем нажмите «Автосохранение», чтобы сохранить все данные. Чтобы записать измерения, нажмите «Начать запись» и выберите, какие данные должны быть визуализированы в режиме реального времени, выбрав из раскрывающегося меню X Signal или Y Signal.
Силовой след скелетных миозинных двигателей, генерирующих силу в построенной структурной иерархии актинов in vitro, демонстрирует устойчивую силу до тех пор, пока плато не будет достигнуто в течение двух-пяти минут. Однако также отмечается, что некоторые пучки актомиозина, которые не генерируют никакой чистой силы и следов силы, появляются как базовый шум или не проявляют существенного чистого увеличения силы в течение 90 секунд из-за низкой концентрации двигателя или неблагоприятной параллельной ориентации нитей. Эта разработка протокола проложит путь к созданию более сложных цитоскелетных анализов in vitro, которые в дальнейшем помогут моделировать крупномасштабные клеточные задачи, такие как деление клеток и сокращение мышц снизу вверх.
