Bu protokolü kullanarak aktin davranışını araştırmak önemlidir, çünkü kullanıcının optik yakalama hassasiyetini kullanarak motor protein topluluk dinamiklerini araştırmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok optik yakalama deneyinde kullanılan geleneksel tek motorlu tek filament oryantasyonunun aksine, aktin yapısal hiyerarşisi içindeki miyozin mekaniğini ölçme yeteneğidir. Bu protokolün bir diğer avantajı, kullanıcının tahlili seçtikleri hiyerarşik sitoiskelet sistemine göre özelleştirmesini sağlayan modüler doğasıdır.
Başlamak için, mikroskop slaytının ortasına birbirinden üç ila dört milimetre uzakta iki parça çift taraflı yapışkan bant uygulayın. Ardından, slaytın kenarından sarkan fazla bandı yırtın veya kesin. Daha sonra, bir kanal oluşturmak için mikroskop slaytının uzun eksenine dik olarak bandın üstüne PLL kaplı kapak kaymasını ekleyin.
Kapak kaymasını bant ve mikroskop üzerine sıkıştırmak için küçük bir tüp kullanarak, bant şeffaf olana kadar iyice kaydırın, böylece akış kanalından sızıntıya neden olabileceğinden bantta kabarcık olmadığından emin olun. PLL akış hücresine 15 mikrolitre seyreltilmiş rodamin aktinini ekleyin ve fazla çözeltiyi akış hücresinden geçirin, ancak akış kanalının kurumasına izin vermeyin. Ardından, bir nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, aktin polimerizasyon tamponunda mililitre kazein çözeltisi başına bir miligram hazırlayın ve sonraki bileşenlerin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için çözeltinin 15 mikrolitresini ekleyin. Ardından, bir nem odasında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, hazırlanan biyotinile aktin ve boncuk süspansiyonuna istenen miyozin konsantrasyonunu ekleyin ve bir pipet ucu ile hafifçe karıştırın.
Daha sonra, derhal akış hücresine istenen miyozin konsantrasyonu ile birlikte süspansiyonun 15 mikrolitresini ekleyin ve 20 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, görüntüleme ve optik yakalama deneyleri sırasında buharlaşmayı önlemek için akış hücresinin açık uçlarını oje ile kapatın. Sistem hazır olduğunda, ekranın sol alt köşesindeki lazer güç düğmesini kullanarak lazeri 50 miliwatt'a kadar açın ve 30 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin.
Deney sırasında görüntüleme ve manipülasyon için bu pencereleri açmak için yazılımdaki aydınlatma, kamera, objektif ve sahne alanı hareket düğmelerine sırayla tıklayın. Açma/Kapama düğmesine tıklayarak mikroskop aydınlatmasını açın ve çubuğu tıklayıp sağa doğru sürükleyerek maksimum güce ayarlayın. Numune alanını açın ve numune tutucuyu mikroskop aşamasından çıkarın.
Ardından akış hücresini ekleyin ve metal numune tutucularla sabitleyerek kapak kaymasının altta olduğundan emin olun. Daha sonra, alt hedefin ortasına 30 mikrolitre RO suyu ekleyin ve numune aşamasını yeniden yerleştirin. Ardından, su boncuğu kapak kaymasına dokunana kadar uzaktan kumandadaki L2'yi kullanarak alt hedefi yükseltin.
Ardından, uzaktan kumandadaki R2 kullanılarak akış hücresine olan mesafenin yaklaşık yarısına ulaşılana kadar üst hedefi düşürün. Daha sonra, akış hücresinin tepesine doğrudan üst hedefin altına 170 mikrolitre RO suyu ekleyin ve suyun yüzey gerilimini kırana ve bir menisküs oluşturana kadar üst hedefi düşürün. Daha sonra, akış kanalına bitişik bandın kenarına ulaşılana kadar uzaktan kumanda üzerindeki ok tuş takımını kullanarak mikroskop aşamasını hareket ettirin ve ardından numune kapısını kapatın.
Ekrandaki objektif penceresini kullanarak, bandın kenarını getirin ve ekrandaki kontrolleri kullanarak üst oka ve alt oka tıklayarak üst hedefe tıklayarak Lazer Hedefi adlı alt hedefi yukarı getirerek odaklanın. Yüzen bir boncuk bulun ve deklanşörü açacak ve yakalama lazerinin numuneye çarpmasına izin verecek olan tuzak deklanşör düğmesine tıklayarak yakalayın. Ardından, ekrandaki tuzak imlecine tıklayın ve yakalama lazerinin konumunu hareket ettirmek için sürükleyin.
Sıkıştıktan sonra, kalibrasyon düğmesine tıklayarak boncuğu kalibre edin. Ardından, Ayarlar'a tıklayın ve yazılım penceresinin sol alt köşesinde bulunan boncuğun çapını ve sahne alanının sıcaklığını yazın. Ardından, Tuzak 1'e, ardından X Signal'e tıklayın ve Çalıştır'a tıklayarak köşe frekansı uyumunu gerçekleştirin.
Ardından, işlev uyumunu optimize etmek için pencerenin içine tıklayıp sürükleyin. Daha sonra, Duyarlılık ve sertlik değerleri için kullan'a tıklayın ve ardından değerleri kabul edin. Ardından, pencereyi kapatın.
Kapak kaymasının yüzeyindeki AF'lere bağlı boncukları arayarak ve birlikte lokalize edilmiş her iki floresan AF'yi arayarak bir aktomiyozin demeti bulun. Beyaz ışık kaynağını açın ve tareti çevirerek her aktin filamentini görüntülemek için uygun filtre küpünü kullanın. Doğrulandıktan sonra, tuzak deklanşör düğmesine tıklayarak paketin üst filamentine bağlı boncuğu yakalayın.
Ardından, ekrandaki kontrolleri kullanarak osiloskop düğmesine tıklayarak verileri kaydedin. Verileri kaydetmeden ölçümleri görselleştirmek için, Başlat'a tıklayın ve ardından tüm verileri kaydetmek için Otomatik Kaydet'e tıklayın. Ölçümleri kaydetmek için, Kaydı başlat'a tıklayın ve X Sinyali veya Y Sinyali açılır menüsünden seçim yaparak hangi verilerin gerçek zamanlı olarak görselleştirileceğini seçin.
İnşa edilmiş in vitro aktin yapısal hiyerarşisi içinde kuvvet üreten iskelet miyozin motorlarının kuvvet izi, iki ila beş dakika içinde bir platoya ulaşılana kadar kuvvette sabit bir rampa sergiler. Bununla birlikte, herhangi bir net kuvvet üretmeyen bazı aktomiyozin demetlerinin ve kuvvet izlerinin temel gürültü olarak göründüğü veya düşük motor konsantrasyonu veya filamentlerin elverişsiz paralel yönelimi nedeniyle 90 saniye boyunca kuvvette önemli bir net artış göstermediği de gözlenmiştir. Bu protokol gelişimi, hücre bölünmesi ve aşağıdan yukarıya doğru kas kasılması gibi büyük ölçekli hücresel görevlerin modellenmesine yardımcı olacak daha karmaşık in vitro sitoiskelet testleri oluşturmaya giden yolu açacaktır.
